OETDK.

   Thermal imaging is widely used in various fields of engineering and industry. Similar systems exist in the medicine as diagnostic tools (e.g. in dermatology, rheumatology or for testing acral circulation). Furthermore, intraoperative thermography is also used in vascular and tumor neurosurgery. Using this technique in neuroscience would potentially have several benefits: it can be used on naive samples in a less invasive way with smaller costs than other methods. Our aim was to test whether thermography can be adapted to experimental neuroscience in a cost-effective manner.    The thermal camera used by us was a handheld industrial Testo 881 thermoimager (courtesy of Dr. Imre Csáky, UD Faculty of Engineering). Adult 2 month-old mice were anesthetized, the skull was opened and the meninges were removed above the convexity of the cortex. After careful rinsing of the brain surface with physiological saline and removal of the excess fluid, control thermal images were taken. In the next steps, 100 µM WAY213613 (EAAT2 glutamate transporter inhibitor) and 120 mM potassium gluconate were applied. As in control, after 3 minutes of incubation, the excess fluid was removed and thermal images were taken. The experimental protocol was finished with washout by saline. The animal and 1 ml of the solutions used were placed on the same heating blanket with 37ºC temperature.    We found that the average brain surface temperature under control conditions was 30.96 ± 0.26 ºC. When the EAAT2 transporter inhibitor WAY213613 was applied, the recorded temperature was 31.31 ± 0.49ºC, whereas increased extracellular potassium concentrations led to a significant temperature increase to 31.8 ± 0.18ºC (p = 0.016).    In conclusion, it is possible to detect temperature changes of the brain surface with an industrial thermoimager. However, as the device was originally not designed for biomedical research, the sensitivity of this recording might be questionable. Also, inhibition of astrocytic glutamate uptake did not cause detectable temperature changes, which is possibly due to the inhibitory actions of anesthetics on extrasynaptic NMDA receptors. In summary, the method can be potentially used in neuroscience but devices specifically designed for this purpose with higher resolution are potentially needed.  

Témavezető: Dr. Pál Balázs Zoltán

  Background: Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is the most common genetic cardiovascular disease characterised by abnormal thickening and hyperdynamic contractility of the left ventricular (LV) myocardium. Currently available approaches provide symptomatic relief to the patients but lack precision in targeting the underlying cause of the disease: excessive sarcomere contractility. Aficamten, a new-generation myosin inhibitor, offers a potential breakthrough by aiming restoration of proper contractile function. Aim: Our aim was to analyse the concentration-dependent effects of aficamten on the contractility and Ca2+ homeostasis of enzymatically isolated canine LV cardiomyocytes. Methods: Cardiomyocytes were loaded with FURA-2-AM fluorescent dye and subsequently placed in an experimental chamber on the stage of an inverted microscope (Nikon TS-100). Contractions and relaxations were recorded at baseline and following exposures to a range of aficamten concentrations (0.1-0.25-0.75-1 μM) at room temperature. Cardiomyocyte contractions were induced by field stimulations at 0.5 Hz, while changes in sarcomere length (SL) and in systolic intracellular Ca2+ concentrations ([Ca2+]i) were monitored in parallel. Results: The negative inotropic effect of 1 µM aficamten was characterised by the reductions in fractional shortening (14.56±0.62% vs. 2.95±0.83%, P<0.05, n=41) duration of contractions, and systolic ejection time (0.90±0.03 s vs. 0.48±0.14 s and 0.67±0.02 s vs. 0.40±0.04 s, respectively, P<0.05 for both, n=41). Velocities of both contractions and relaxations were decelerated (1.08±0.10 µm/s vs. 0.31±0.11µm/s and 1.38±0.09 µm/s vs. 0.24±0.09 µm/s, respectively P<0.05 for both, n=41), which could further contribute to the reduction in contractility. Aficamten did not exert any significant influence on the parameters of [Ca2+]i regardless of the applied drug concentration. Conclusion: Our results confirmed that aficamten exerts its negative inotropic effects by selectively modulation of the activity of sarcomeric myosin, portraying it as a highly promising therapeutic option for HCM.  Current and future clinical trials are expected to clarify further technical details and hopefully support the clinical introduction of direct myosin inhibitors in the management of HCM.

Témavezető: Dr. Sárkány Fruzsina és Prof. Papp Zoltán

Communication between the immune and nervous systems is essential for regulating inflammation, tissue repair, and host defense against pathogens. The epidermis contains various immune cells including Langerhans cells (LCs), which arise from embryonic precursors like other tissue resident macrophages, but are characterized by typical DC functions. LCs are associated anatomically with neurons that produce neuropeptides, providing a putative mechanism of neuro-immune crosstalk in the epidermal compartment. In our previous experiments we identified the expression of neuropeptide receptors in moLCs. Of the ligands of these receptors only B-type natriuretic peptide (BNP) had significant effects on moLC function. BNP plays key roles in itch signaling on all levels, from skin cells, to sensory neurons and the spinal cord. It can be produced not only by sensory nerve endings but also by keratinocytes. Because of its high abundance in the epidermis it is especially important to determine its effect on LCs. Our objectives were to validate the expression of NPR1 in our moLCs, and in situ in the epidermis. Furthermore, we sought to understand how BNP impacts moLCs' pro-(or anti-) inflammatory cytokine production, T cell activating capability, as well as the immunomodulatory pathways identified in our previous RNASeq experiments. We verified our RNASeq results with qPCR, and Western blot on moLCs in vitro. Our immunofluorescence staining on skin sections revealed the colocalization of the LC marker CD1a and NPR1 in the epidermis. BNP had minimal effects on cytokine production when applied alone, but decreased the production of IL-6 induced by TLR3 and TLR7/8 activation. Despite these modest effects T cell proliferation was significantly decreased by coapplication of BNP with the abovementioned inflammatory stimuli. RNASeq results also revealed that multiple tolerogenic markers were induced upon BNP treatment, of which we were able to validate the induction of IDO1 expression. IDO is an immune checkpoint molecule in the sense that it is an immunomodulatory enzyme produced by alternatively activated macrophages and other immunoregulatory cells. IDO is known to suppress T and NK cells, generate Tregs and myeloid-derived suppressor cells, and also support angiogenesis. Our results show that NPR1 is widely expressed in the epidermis, including on LCs. This provides a novel anti-inflammatory component of neuroimmune communication.

Témavezető: Dr. Szöllősi Attila Gábor és Dorottya Horváth

The precuneiform nucleus is located in the tectal region of the mesencephalon; dorsal from the pedunculopontine nucleus and rostral from the cuneiform nucleus. These structures form the mesencephalic locomotor region (MLR). There are several studies describing the morphology and functions of glutamatergic neurons in the cuneiform and pedunculopontine nuclei but these data are missing from the precuneiform nucleus. In this project, I aimed to search for correlations between morphological and electrophysiological parameters of the precuneiform nucleus. Mice expressing Vglut2- tdTomato promoter were employed in these experiments. Patch clamp recordings were previously performed on glutamatergic neurons. During recordings, the neurons were labelled with biocytion.  After using the recovery protocol and taking confocal images, reconstruction of these neurons were done with the Neurolucida software. With Neurolucida Explorer software, morphological data were extracted from the reconstructed images. The previously recorded electrophysiological data were correlated with the morphological data obtained with reconstruction. Cell body parameters correlated with action potential firing rate (R2 value correlating the cell body perimeter and 1st interspike interval was 0.6, with a slope of 1.34, direct correlation) and high threshold membrane potential oscillatory parameters (cell body perimeter and maximum power:  R2 = 0.6, slope = 0.39, direct correlation; cell body area and the maximum power: R2 = 0.542, slope = 0.06, direct correlation). The dendritic number compared with input resistance revealed inverse correlation (R2 = 0.486; slope = -259.2). The dendritic length and the frequency of membrane potential oscillations showed inverse correlation (R2 = 0.686, slope = -0.0354). We also compared the dendritic length with action potential firing rate which showed inverse correlation ( R2 = 0.5265, slope = -0.014). Lastly, we found an inverse correlation between the dendritic length and the adaptation index measuring spike frequency adaptation (R2 = 0.376, slope = -5.213). In conclusion, somatodendritic morphology of glutamatergic neurons seem to determine certain membrane properties related to action potential firing frequency and pattern.  Regarding this, there are similarities between glutamatergic neurons of the precuneiform nucleus and the related areas. Our data support the theory that glutamatergic neurons of the MLR belong to the same population.

Témavezető: Balazs Pal

A barna/bézs adipocitákban kifejeződő uncoupling protein (UCP) 1 szétkapcsolja az elektron transzport-láncot és az ATP szintézist. A belső mitokondriális membránon keresztül történő proton csorgás következtében hő szabadul fel, mely folyamat alatt az adipociták nagy mennyiségben használnak fel tápanyagokat (pl. glükóz, zsírsavak és aminosavak). Munkacsoportomban sejtpermeábilis cAMP analóggal modellezték a hideg hatására bekövetkező szimpatikus idegrendszeri választ adipocitákban, melynek hatására nemcsak a termogenikus markerek, hanem a mio-inozitol transzporter, SLC2A13 génjének kifejeződése is növekedett. A mio-inozitolról korábban leírták, hogy fokozza az anyagcsere aktivitást és az inzulinérzékenységet 2-es típusú diabéteszben szenvedőkben. Jelen vizsgálatban a mio-inozitol kezelés - nagy hőtermelő képességgel rendelkező - humán nyaki eredetű zsírsejtekre kifejtett hatását kívántuk feltérképezni. Primer szubkután és mély nyaki zsírszövet-eredetű sztróma sejteket adipocitákká differenciáltattunk 14 napon át, majd dibutiril-cAMP kezelést alkalmaztunk 10 órán keresztül, mio-inozitol jelenlétében vagy hiányában. Az SLC2A13 valamint a termogenikus gének és fehérjék kifejeződését RT-qPCR-ral és western-blottal határoztuk meg. Az adipociták oxigén fogyasztását és extracelluláris acidifikációját Seahorse XF96 Extracellular Flux Analyzer-rel mértük. A karnitin-palmitoil transzferáz inhibitor etomoxir (ETO) illetve az ATP-szintáz gátló oligomycin hozzáadását követően meghatároztuk az ETO-rezisztens illetve a proton csorgásos légzést, mely paraméterek a sejtek glükóz és aminosav felhasználásáról illetve hőtermeléséről adnak felvilágosítást. Mio-inozitol hatására növekedett a hőtermelésért felelős gének (UCP1, DIO2, PM20D1, CPT2 és KCNK3) kifejeződése valamint az ETO-rezisztens és a proton csorgásos oxigén fogyasztás az aktiválatlan szubkután és mély nyaki adipocitákban. A mio-inozitol azonban nem fokozta tovább a cAMP által vezérelt termogenikus aktivációt. Továbbá, mio-inozitol jelenlétében emelkedett az adipociták extracelluláris acidifikációja, mely fokozott glikolízisre utalhat. A nagyobb glükóz felhasználást az inzulin-független GLUT3 transzporter génjének mio-inozitol általi felszabályozódása biztosíthatja. Eredményeink arra utalnak, hogy a mio-inozitol fokozza a humán adipociták metabolikus aktivitását, mely új stratégiát nyithat az elhízás és az inzulinrezisztencia fékezésére.

Témavezető: Dr. Kristóf Endre Károly és Dr. Arianti Rini

A krónikus polineuropátia a 2-es típusú cukorbetegség egyik leggyakoribb következménye, amely a betegek több, mint harmada esetén neuropátiás fájdalom (DNP) kialakulásához vezet. A DNP kezelésére használatos első vonalbeli szerek gyakran teljesen hatástalanok, jelezve, hogy a DNP kialakulásának mechanizmusa nem teljesen ismert. Irodalmi adatok alapján a DNP hátterében neuroinflammáció kialakulása is tetten érhető, ezért munkánk során immuncitokémiai módszerek segítségével vizsgáltuk, hogy a diabéteszes betegekben felhalmozódó citotoxikus metabolit, a metilglioxál (MGO) képes-e gerincvelői asztrocita-mikroglia kokultúrában reaktív gliózist, illetve proinflammatorikus citokinek termelését indukálni. Mivel a női nem a DNP egyik ismert kockázati tényezője, és a neuropátiás fájdalom nem-neuronális mechanizmusai erőteljes nemfüggést mutatnak, kísérleteink során külön kezeltük a hím és nőstény egerekből származó tenyészeteket.   Az MGO 100 nM-os koncentrációban jelentősen fokozta a TNFα expresszióját hímekből izolált asztrocita és mikroglia sejteken. Az MGO-val indukált emelkedett TNFα termelést asztrocitákban a TRPA1 antagonista HC030031, mikrogliában viszont az integrált stresszválasz inhibitora, az ISRIB védte ki. A nőstény egerekből izolált kokultúrában az MGO az IL-1β fokozott termelését idézte elő, erőteljesebben mikrogliában és kisebb mértékben asztrocitákban. Mikroglia sejtekben az integrált stresszválasz és a TRPA1 gátlása egyaránt mérsékelte, de ki nem védte az MGO hatását az IL-1β expressziójára. Ugyanezekben a tenyészetekben azonban az ISRIB jelenlétében elmaradt az asztrociták emelkedett IL-1β termelése az MGO kezelést követően. Eredményeink alapján a diabéteszes neuropátiás fájdalom hátterében meghúzódó neuroinflammáció kialakulásában az MGO által indukált reaktív asztrociták és mikroglia sejtek szerepe egyaránt feltételezhető. Az MGO hatásait a gliasejtekben két nemben eltérő mechanizmusok közvetítik, és különböznek a neuroinflammáció kialakításában szerepet játszó, glia eredetű citokinek is. Eredményeink alapján felvetődik az integrált stresszválasz és a TRPA1 gátlásának lehetősége a diabéteszes neuropátiás fájdalom enyhítésére.

Témavezető: Dr. Hegyi Zoltán és Dr. Dócs Klaudia

A tumorsejtek túlélésük érdekében folyamatosan alkalmazkodnak környezetükhöz, melyet többek között egyes fehérjéik, például a membránjukban kifejezett ioncsatornák mutációival képesek megvalósítani. Kutatásunk témáját a feszültség-kapuzott nátrium csatornák jelentik, melyek családja kilenc izoformát tartalmaz (NaV1.1-1.9). Ezen csatornák fontos szerepet játszanak az ingerelhető sejtekben (ideg és izom) az akciós potenciálok létrehozásával, de számos sejtfunkcióban vesznek részt nem-ingerelhető sejtekben is. Rendellenes működésük, vagy megváltozott expressziós szintjük kapcsolatba hozható számos betegséggel, mint például aritmiák, miotóniák, epilepszia, valamint neurodegeneratív és daganatos elváltozásokkal. Munkacsoportunk korábban azt is kimutatta, hogy nem-ingerelhető sejtekben, kondrocitákban és dendritikus sejtekben a NaV csatornák expressziójának változása erősen összefügg a sejtek differenciációjával. Így e csatornák működésének és sejtfunkciókban betöltött szerepének részletes megismerése elengedhetetlen. Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a NaV1.5, ami elsősorban a felnőtt humán szívben fejeződik ki, szintén jelen van emlőrák sejtekben is, és hozzájárulhat metasztatikus képességükhöz. E sejtekben azonban a csatorna neonatális variánsának (nNaV1.5) dominanciáját mutatták ki a felnőtt variáns (aNaV1.5) felett. A nNaV1.5 hét aminosavban különbözik az aNaV1.5 csatornától, ami okozhat jelentős eltéréseket a csatornák működésében, így erre specifikus gátlószerek keresése, fejlesztése út lehet az emlőkarcinóma kezelése felé. Méréseink célja a neonatális és felnőtt NaV1.5 csatornák biofizikai paramétereinek összehasonlítása, valamint az emlőrák sejtvonalon a NaV csatornák expressziós mintázatának feltérképezése. E célból patch-clamp technikával, teljes-sejt konfigurációban vizsgáltuk az MDA-MB-231 emlőrák sejtvonalon a NaV áramokat. Az izoforma-specifikus NaV gátlószer, a tetrodotoxin használatával egy erre szenzitív és egy erre rezisztens populációt figyeltünk meg, melyek különböző feszültség-protokollokkal meghatározott kapuzási paraméterei is jelentősen eltértek, ami egy másik izoforma jelenlétére utal. A továbbiakban célunk a daganatos sejtek által kifejezett NaV csatornák pontos azonosítása molekuláris biológiai módszerekkel, továbbá heterológ expressziós rendszert alkalmazva a felnőtt és a neonatális csatornák biofizikai paramétereinek összehasonlítása a rákos sejtek környezeti adaptációs mechanizmusának jobb megértése céljából.

Témavezető: Prof. Varga Zoltán és Dr. Fehér Ádám

Bevezetés: A titin a szarkomer óriásfehérjéje, mely kulcsfontosságú szerepet tölt be a szívizomsejtek passzív rugalmasságában. A titin molekulában található „rejtett” ciszteinek az S-glutationiláció legfontosabb célpontjai, azonban ezek a rejtett oldalláncok csak a szívizomsejtek extrém megnyúlása esetén, következésképpen a fehérje kitekeredése révén válnak elérhetővé, ezáltal csökkentve a szívizomsejtek passzív feszülését (Fpasszív). Ugyanakkor kevésbé ismert, hogy a titin S-glutationilációja hogyan befolyásolja a szívizomsejtek passzív rugalmasságát fiziológiás szarkomerhosszon (SL) az életkor előre haladtával. Kísérleteink során vizsgáltuk az S-glutationiláció Fpasszív erőre kifejtett hatását eltérő szarkomerhossz mellett a születést követően. Anyagok és módszerek: Az Fpasszív vizsgálatát különböző fejlettségi állapotú (0, 7, 21 napos és 8 hetes felnőtt) kontroll Wistar patkányokból nyert permeabilizált bal kamrai szívizomsejteken végeztük. Az S-glutationiláció in vitro vizsgálatát szekvenciálisan alkalmazott 10 mM oxidált glutation (GSSG), redukált glutation (GSH, 10 mM) és dithiotreitol (DTT, 10 mM) redukáló szer alkalmazásával végeztük fiziológiás (2,2 µm) és extrém SL (2,8 µm) mellett. Eredmények: Az Fpasszív értéke szignifikánsan csökkent GSSG kezelést követően a 0, 7 és 21 napos szívizomsejtekben (0,07±0,01 kN/m2, 0,24±0,03 kN/m2 és 0,72±0,03 kN/m2, P<0,05, n=6-8) a kontroll csoporthoz viszonyítva (0,14±0,02 kN/m2, 0,30±0,02 kN/m2 és 0,86±0,02 kN/m2, rendre, n=6-8). A csökkent Fpasszív értékeket a GSH kezelés a kontroll közeli értékre állított vissza a 7 és 21 napos szívizomsejtekben (0,33±0,03 kN/m2 és 0,79±0,04 kN/m2, n=6-8), ez a hatás azonban a 0 napos állatokban kifejezettebbnek bizonyult (0,22±0,02 kN/m2, P<0,05, n=8). Felnőtt szívizomsejtekben  2,2 µm SL mellett az Fpasszív (1,29±0,06 kN/m2) GSSG vagy GSH kezelést követően nem változott, míg a 2,8 µm SL-en alkalmazott GSSG kezelés hatására szignifikánsan csökkent (0,56±0,11 kN/m2, P<0,05, n=2), melyet a GSH a kontroll közeli értékre revertált (1,23±0,05 kN/m2, P<0,05, n=2). Az Fpasszív GSSG általi változásának mértéke a kor előrehaladtával csökkent (Fpasszív: 0 nap: 44±5%, 7 nap: 24±4%, 21 nap: 17±3%, P<0,05, felnőtt: -2±3%, P>0,05, n=6-8). Konklúzió: A szívizomsejtek merevségének csökkenése a titin fehérjében található „rejtett” ciszteinek S-glutationilációjával kiváltható, melynek mértéke a szarkomer struktúra érésével párhuzamos csökken.

Témavezető: Dr. Bódi Beáta