OETDK.

Breast cancer leads the incidence rankings among female cancer patients. The complex and diverse molecular mechanism of the disease represents a challenge for treatment and prevention. Studies show that serotonin (5HT) may activate tumor cell proliferation and tumorigenic signaling pathways. In the mammary gland, prolactin induces the expression of tryptophan hydrolase-1 (TPH1), which is the rate limiting enzyme for serotonin production. Serotoninergic depends on several proteins including the5HT  receptors, TPH1, the serotonin transporter  SLC6A4 (SERT), and monoamino oxydases (MAO-A). While the overexpression of TPH1 in breast cancers has been reported, its pro-tumorigenic role is unclear. We determined that the reduction of cellular 5HT levels in MCF7 breast cancer cells by inhibiting either TPH1 or SERT was associated with growth suppression in a dose-dependent manner. Meanwhile, the levels of TPH1 were unchanged. This was further enhanced by the cancer preventive rexinoid bexarotene. However, Western Blots detecting TPH1 protein levels in immortalized non-malignant breast cells (HME-hTert)  showed a reduction in TPH1 protein levels when treated with Paroxetine (SSRI), and further suppressed by the paroxetine+bexarotene combination. To study the relationship between serotonin levels and its proliferative activity we conducted a cloning experiment for the TPH1 gene. We used HEK293 cell line RNA for the RT reaction. For the PCR amplification of the TPH1 DNA, we designed primers that allowed us to introduce new restriction sites at the 3’ and 5’ ends of each gene fragment. Two additional restriction sites were identified in the sequence for the subsequent assembly. The TPH1 gene was cloned in 3 separate pieces from gradient PCRs by blunt-end cloning in pJet vectors. After bacterial transformation, clone selection, and plasmid isolation, we confirmed the integrity of the sequences by restriction digestion, PCR, and sequencing.  The TPH1 DNA gene fragments were reassembled by sequential restriction sites and inserted into the expression vector for transfection. Future steps include characterizing the effects of overexpressed TPH1 enzyme on intracellular/extracellular 5HT levels and other serotoninergic system proteins, cell proliferation, and cytoskeletal changes.

Témavezető: Dr. Uray Iván és Lengyel Máté

The 67 kDa laminin receptor (67LR) is a non-integrin cell surface receptor derived from a smaller 37 kDa precursor (37LRP) and was originally identified as a binding protein of laminin involved in cell adhesion. 67LR has also been identified as a high-affinity receptor for epigallocatechin-3-gallate (EGCG). The binding of EGCG to 67LR can suppress tumor growth and induce apoptosis through multiple signaling pathways. Among these, the EGCG/67LR/cAMP/PKA/PP2A/MP signal cascade induces the sequential activation of protein phosphatase 2A (PP2A) and myosin phosphatase (MP) leading to dephosphorylation and activation of tumor suppressor proteins. Elements of this activation pathway, e.g., the EGCG/67LR interaction and the specific trimeric PP2A holoenzyme activated by EGCG are not fully characterized. Previously, the B56δ regulatory subunit of PP2A has been shown to be activated by PKA-catalyzed phosphorylation in neurons, raising the possibility that members of the B56 family are involved in the EGCG/67LR pathway. This project aims to establish model systems to characterize the EGCG-67LR interaction and to explore the role of B56 isoforms in the EGCG/67LR pathway. Flag-tagged 37LRP was expressed in HEK293AD cells and the subcellular localization of the protein was analyzed. We detected the presence of the recombinant receptor protein in the plasma membrane fraction, therefore these cells will be suitable for interaction studies to uncover the specificities of EGCG binding with membrane-bound 67LR. To identify the specific regulatory B subunit of PP2A involved in the EGCG/67LR signaling, we planned to use an inducible CRISPR/Cas9 system. Expression of guide RNAs to B56γ and B56δ was induced by doxycycline treatment in HeLa cells stably expressing Cas9, and the elimination of these specific B56 subunits was proved by qPCR. The effect of B56 gene knockdown on MP activity was tested by analyzing the phosphorylation of the myosin phosphatase target subunit 1 (MYPT1). Elimination of B56γ subunit resulted in elevated phosphorylation of MYPT1 at the inhibitory phosphorylation sites, suggesting that B56γ may be required to target PP2A to MYPT1. These data help to uncover the molecular interactions leading to phosphatase activation in the EGCG/67LR pathway.

Témavezető: Dr. Andrea Kiss

Dendritic cells (DCs) are a specialized subset of immune cells that play a crucial role in antigen presentation and in initiating and maintaining strong T-cell responses against tumors. DCs can be generated in vitro from various sources, including bone marrow derived cells or peripheral blood monocytes. However, the use of embryonic stem cells (ESCs) as a source for DC generation offers several advantages, such as their unlimited self-renewal capacity and potential to differentiate into any cell type. The use of ESCs for generating DCs holds great promise, yet it is essential to understand the factors influencing their development. In this study, we focus on the impact of the transcription factor IRF4 (Interferon Regulatory Factor 4) on the differentiation of mouse ESCs into myeloid DC progenitors. For this study, I used two chemically inducible ESC clones (C1 and C3) carrying the IRF4 transgene. To generate ESC-derived blood cells, first embryoid bodies (EBs) were generated from the transgenic ESCs and collected on day 6. The disaggregated EB derived cells were further differentiated in GM-CSF containing medium for 3 or 6 days. The induction of the IRF4 transgene occurred from day 6 to day 9 or 12 through treatment with doxycycline. The differentiation process was monitored with flow cytometry detecting specific markers (CD45 and CD34) to evaluate the formation of myeloid blood cells. In addition, gene expression analysis was employed with quantitative RT-PCR to assess the IRF4 inducibility. We found a significant decrease in the percentage of CD45+ cells upon the enforced expression of Irf4 on both days 9 and 12. Furthermore, fewer CD34+ cells were detected on day 9 compared to day 12. Additionally, the results from RT-PCR analyses revealed an increased expression of IRF4 when the cells were induced by doxycycline during the differentiation process. Together these results suggest that IRF4 suppresses ESC-derived myeloid blood cell development and exerts a general inhibitory effect on ES-DC development.

Témavezető: Dr. István Szatmári

Tankyrase 1 (TNKS1) and tankyrase 2 (TNKS2) are members of the PARP enzyme family, which consists of 17 members. PARP enzymes participate in poly-ADP-ribosylation of target proteins. Tankyrases are involved in various cellular functions, of which telomere length maintenance was described first. Tankyrase enzymes have recently been found to play a role in metabolic regulation and energy homeostasis. The aim of this study is to better understand the TNKS1 and TNKS2 mediated effects governing the differentiation of white adipocytes. Additionally, we would like to ascertain the proprietary tankyrase mediated features in white adipose tissue. We generated TNKS1 and TNKS2 single and TNKS1/TNKS2 double knockout 3T3-L1 cell lines using the CRISPR / Cas9 method. In the experiments, differentiated 3T3-L1 preadipocytes were applied as a model. The differentiation of the 3T3-L1 preadipocytes consists of a clonal expansion phase and a terminal differentiation phase. The mRNA expression of tankyrases was seen to increase in the terminal differentiation phase. This suggests that tankyrases play a role in terminally differentiated white adipocytes. In prior experiments we performed an RNAseq analysis on these clones. Based on the results, we observed that there is a large cluster of genes that change similarly in each KO, but there is a large cluster that is specific for TNKS1 and TNKS2. Currently, we are confirming the results of the RNAseq experimentally to formulate a working hypothesis for the role of TNKS1 and TNKS2 in adipocyte differentiation.

Témavezető: Prof. Bay Peter és Rauch Boglarka

A CXC motívum kemokin ligand 1 (CXCL1), a CXC kemokin alcsaládhoz tartozó citokin, amely részt vesz számos gyulladásos folyamat kialakulásában és egyes tumorok progressziójában, mikrokörnyezetének alakításában. A CXCL1-CXCR2 blokkolása gátolja a tumor progresszióját és csökkenti a makrofágok toborzását a tumor mikrokörnyezetében. Első célunk az volt, hogy megvizsgáljuk két anti-inflammatórikus, rákmegelőző tulajdonságokkal bíró szer, a bexarotene (Bex) és a carvedilol (Carv) hatását a CXCL1 kemokin expresszióját makrofágokban és tumor sejtekben. A CXCL1 génexpresszióját qPCR módszerrel vizsgáltuk kezeletlen, valamint LPS-sel aktivált THP-1 humán monocyta sejtekben. A THP-1 sejtvonalban aktivációtól függetlenül Bex hatására megnőtt, Carv hatására pedig csökkent a CXCL1 expresszóiója. A két szer együttes alkalmazásakor csak a makrofággá differenciált sejtekben volt megfigyelhető növekedés. A THP-1 sejtek felülúszójával HCC1143 tripla negatív emlőrák sejteket kezeltünk, bár a tumor sejtek is kifejezték a CXCL1-et, ennek szintjében a kontroll mintákhoz képest a Bex vagy a Carv kezelés sem idézett elő különbséget, azonban az LPS aktiválás hatására szignifikánsan emelkedett a CXCL1 génexpresszió. Ebből arra következtettünk, hogy a CXCL1 termelődését kemopreventív szerekkel a mononukleáris sejtek szintjén várhatjuk. A CXCL1 hatásának sejtszintű, in vitro vizsgálata céljából a gén expressziós vektorba való klónozását tűztük ki célul. Első lépésként a gén 3’ végére specifikus primerrel készítettünk cDNS-t, telomerázzal immortalizált primer emlő epithél sejtekből izolált RNS-ből kiindulva. A CXCL1 cDNS-t specifikus klónozó primerekkel amplifikáltuk, melyek a későbbiekben alkalmazni kívánt XhoI és XbaI restrikciós enzimek hasítási helyeit tartalmazták. Az előállított inzertet pJET1.2 klónozó vektorba ligáltuk, kompetens DH5α baktériumokba transzformáltuk, majd ampicillin szelekció után izoláltunk klónokat. A klónok szelekciója restrikciós enzimekkel, a klónozó primerekkel, majd az inzert szekvenciáján belül tapadó primerpárral futtatott PCR reakcióval történt. A klónozott gént kapilláris szekvenálással validáltuk. Végül az azonosított inzertet mCherry és EGFP expressziós vektorokba helyeztük át. További célkitűzésünk a CXCL1 erőltetett kifejezése az expressziós vektor segítségével, majd a fehérje parakrin és autokrin hatásainak vizsgálata nem transzformált, illetve malignus emlő epithél sejtekre.

Témavezető: Dr. Uray Iván Péter és Lengyel Máté

Bevezetés: A malignus daganatok kialakulását és progresszióját nagyban meghatározza a tumorsejtek által indukált tolerogén immunológiai környezet. A makrofágok széles funkcionális plaszticitással rendelkező immunsejtek, amelyek a tumoros mikrokörnyezetben alternatívan aktivált (M2) fenotípust vesznek fel. Ezek a tumor-asszociált makrofágok anti-inflammatorikus és angiogenikus faktorok termelése révén segítik a daganat növekedését és metasztázis képzését. Ebből kifolyólag a makrofágok M2 irányú polarizációját gátló és a pro-inflammatorikus, M1 irányú aktivációjukat elősegítő mechanizmusok részletes feltárása onkoterápiás jelentőséggel bírhat. Célkitűzés: Kísérleteink során in vitro rendszerek segítségével igyekeztünk kimutatni, hogy a sokrétű szabályozó funkciókat betöltő poli(ADP-ribóz) polimeráz (PARP) enzimcsalád egyik képviselője, a PARP-14 milyen szerepet játszik a makrofágok polarizációjában. Módszerek: A daganatos mikrokörnyezet modellezéséhez THP-1 monocyta sejtekből differenciáltattunk makrofágokat, majd ezeket JIMT-1 emlőrák sejtekkel inkubálva egy 3-dimenziós szferoid ko-kultúra rendszert hoztunk létre. A szferoidokat PARP-14 enzimre specifikus gátlószerrel (MCD-113) kezeltük, majd RT-qPCR módszerrel megmértük az M2 makrofágokra jellemző markerek expresszióját, illetve a tumorsejtek apoptózisát - a sejtek fluoreszcens jelölése után - konfokális mikroszkópiával vizsgáltuk. A gátlószer M1 polarizációra gyakorolt hatását is ellenőriztük THP-1 eredetű makrofág sejteken. A PARP-14 gátlás hatását primer humán monocytákból differenciáltatott M2 makrofágokon is tanulmányoztuk. Eredmények: A PARP-14 enzim gátlása szignifikánsan csökkentette az M2 markerek expresszióját a szferoid modellben és a primer humán monocytákból differenciáltatott makrofágok esetén is, továbbá a szferoidban fokozta a daganatsejtek apoptotikus pusztulásának mértékét. A THP-1 eredetű makrofágok esetén a gátlószer alkalmazása növelte az M1 markerek kifejeződését. Következtetés: A PARP-14 enzimre specifikus MCD-113 gátlószer alkalmazása az általunk használt modellekben eredményesen visszaszorította a makrofágok M2 irányú polarizációját, és felerősítette a klasszikus, M1 irányú aktivációs útvonalat, amely a daganatos mikrokörnyezetben egy erőteljesebb és hatékonyabb tumorellenes immunválasz kialakulását eredményezheti.

Témavezető: Prof. Virág László és Prof. Bácsi Attila

A humán transzglutamináz enzimcsalád legismertebb funkciója a glutamin és lizin fehérje oldalláncok között izopeptid kötés kialakítása Ca2+-függő módon. A legtöbbet kutatott családtag a Transzglutamináz 2 (TG2) fehérje, amely a transzglutamináz aktivitás több típusa mellett katalizálhat GTPáz, ATPáz, protein diszulfid izomeráz, fehérje kináz aktivitásokat is. Interakciós partnerként hozzájárul fehérje komplexek működéséhez. Szerepet játszik például a membrán integritásának, sejtek letapadásának és migrációjának szabályozásában, jelátviteli folyamatokban, illetve a sebgyógyulásban, angiogenezisben. Az emberi testben szinte mindenhol kimutatható, a HUVEC sejtekben is nagy mennyiségben expresszálódik, de az endotél funkciókban játszott szerepe nem teljesen tisztázott. A TG2 HUVEC sejtekben játszott szerepének feltárása érdekében célul tűztük ki TG2 knock out (génkiütött) HUVEC sejtvonal létrehozását és annak a vad típusú sejtekkel történő összehasonlítását. A CRISPR/Cas9 génszerkesztési eljáráshoz egy immortalizált, vad típusú (WT) HUVEC sejtvonalba a TG2 specifikus gRNS-t és Cas9-et egyben kódoló vektort transzfektáltunk. A potenciális TG2-KO sejteket puromycinnel szelektáltuk, majd egyedi TG2-KO HUVEC sejtvonalakat (klónokat) állítottunk elő. A TG2 kiütését Western Blottal és aktivitás méréssel igazoltuk. A TG2 kódoló szekvenciában okozott változást és a potenciális off-target helyek épségét az izolált genomi DNS adott szakaszainak amplifikálása és TOPO klónozása után szekvenálással erősítettük meg egy TG2-KO HUVEC sejtvonalból. A TG2 endotél sejtekben betöltött szerepének tanulmányozásához a TG2-KO és a WT HUVEC sejteket hasonlítottuk össze. A TG2-KO sejtek nem mutattak csökkent adhéziós tulajdonságot fibronektin felszínen, de a TG2-KO sejtek migrációja sebzési teszttel vizsgálva szignifikánsan csökkent. A TG2-KO HUVEC sejtekben mind az endogén, mind az indukált teljes ROS szintet szignifikánsan alacsonyabbnak találtuk, míg a resazurin-resorufin reduktív átalakítását szignifikánsan magasabbnak. A kapott eredmények értelmezéséhez és további TG2-függő változások feltárásához teljes RNS szekvenálást végeztünk, aminek az analízise még folyamatban van. Eredményeink hozzájárulhatnak a TG2 fehérje endotél sejtekben és így a kardiovaszkuláris rendszer egészséges és patológiás működésében játszott szerepének a megértéséhez. A kutatást az NKFIH K129139 projekt támogatta.

Témavezető: Dr. Király Róbert és Csaholczi Bianka

Az inzulinrezisztens állapotban (InR) az inzulin-függő szövetek, így a vázizom és a zsírszövet inzulin érzékenysége és glükóz felvétele csökken. Az InR során az inzulin jelátviteli út több pontján azonosítottak már kórós elváltozásokat, például a Ser/Thr kinázok aktiválódását, melyek fokozzák az inzulin receptor szubsztrát 1 (IRS1) és más inzulin jelátviteli elem foszforilációját a szeril oldalláncokon, míg a tirozil oldalláncok foszforilációja csökken.  Azonban a szakirodalom alapján ismerünk olyan szeril oldalláncokat is, amelyek fiziológiás állapotban a Rho-asszociált protein kináz (ROK) által foszforiláltak és a sejtek inzulin érzékenyítésében vesznek részt, így például az IRS1 Ser638/639-P. A miozin foszfatáz (MP) egy szerin/treonin specifikus foszfatáz, amely egy katalitikus PP1c, illetve egy  MYPT1 szabályozó alegységből áll. Aktivitását már számos folyamatban megfigyelték, és  ugyancsak ismert a ROK szubsztrátjainak defoszforilációjában betöltött szerepe. Emiatt hipotézisünk, hogy a MP kulcsfontosságú szerepet tölt be az InR folyamatában. Kísérleteink során ko-immunprecipitációval kimutattuk a tsA201 sejtekben overexpresszált Flag-tag MYPT1 (FT-MYPT1) fehérje és az IRS1 kölcsönhatását. Míg a fiziológiás körülmények között a két fehérje kölcsönhatása elhanyagolható volt, addig a magas glükóz és inzulin mellett tenyésztett InR C2C12 egér vázizom sejtek lizátumában a FT-MYPT1 fehérjével kölcsönható IRS1 mennyisége szignifikánsan emelkedett. A fehérje-fehérje kölcsönhatást in vivo is bizonyítottuk immunfluoreszcens festésen alapuló Duolink Proximity Ligation Assay segítségével. Eredményeink alapján sikerült bizonyítani a MP és az IRS1 szubsztrát kölcsönhatását in vitro és in vivo inzulinrezisztens állapotban. A fiziológiás és InR C2C12 sejtekben a MP enzim szabályzó szerepét a MYPT1 overexpresszálásával szemi-kvantitatív Western blot analízissel vizsgáltuk. Az overexpresszió hatására szignifikáns csökkenést tapasztaltunk az inzulin érzékenyítő szeril oldalláncok foszforilációjában. Ezek alapján a MP gátlószerei inzulinérzékenyítő hatással bírhatnak és potenciális terápiás lehetőséget nyújthatnak az InR terápiájában.

Témavezető: Dr. Lontay Beáta

A poszttranszlációs fehérjemódosítások (PTM) során a polipeptidlánchoz kapcsolódó kémiai csoportok képesek megváltoztatni a fehérjék 3D szerkezetét, kölcsönhatásait, rendeltetési helyét, funkcióját és élettartamát. E módosítások, köztük az ADP-riboziláció szerepének és szabályozásának megfejtése napjainkban egyre növekvő jelentőséget nyer mind betegség biomarkerek azonosítása, mind a gyógyszertervezés és -fejlesztés szempontjából. Korábbi munkánk során egy ADP-ribózhoz specifikusan kötődő fehérje domén (eAf1521) segítségével ADP-ribozilációs módosításokat azonosítottunk különféle sejtek mitokondriumaiban (mitoADPr), melynek mértéke az elektrontranszportláncot, ill. a mitokondriális H+-grádienst befolyásoló vegyületek hatására változott. Az ADP-riboziláció ismert kapcsolata a NAD+-metabolizmussal felvetette, hogy a jelölődés a trikarbonsav-ciklus és az elektrontranszport függvényében változó NAD+-koncentrációval lehet összefüggésben. Új kísérleteinkben U2-OS sejtek ADP-ribózzal, NAD+-dal, NADH-val történő feltöltésével kizártuk, hogy az eAf1521 ezekkel a kis metabolitokkal keresztreagál, a sejtek DNáz és RNáz kezelésével pedig megerősítettük, hogy a felismert módosított molekula/ák fehérje természetűek. Vizsgáltuk az U2-OS sejtek NAD+-homeosztázisa és a mitokondriális ADP-riboziláció közötti kapcsolatot egy a NADH/NAD+ arányt érzékelő genetikailag kódolt bioszenzor (Peredox) segítségével, ill. a főbb metabolikus útvonalak farmakológiai manipulálásának hatását a mitoADPr-ra. A két legnagyobb kihívás a módosított fehérjék és a módosítást végző enzimek azonosítása, melyek feltételei annak, hogy ezekhez az ADP-ribozilációs módosításokhoz funkcionális következményeket rendelhessünk. Ennek érdekében egyrészt CRISPR/Cas9 módszerrel inaktiváltunk több ADP-riboziltranszferázt kódoló gént, megállapítva, hogy a mitokondriális ADP-ribozilációért nem a PARP1 enzim felelős. Másrészt a mitokondriális ADP-ribozilált fehérjék keresésére adaptáltunk egy irodalmi módszert. A feltételezett célfehérjék azonosításához az ADPriboDB2.0 ADP-ribozilált fehérje adatbázis és a MitoCarta3.0 mitokondriális fehérje adatbázis adatait, irodalmi tömegspektrometriás adatokat, illetve a saját proteomikai adatainkat vetettük össze. V. B. Szent-Györgyi Hallgató munkáját a Nemzeti Tudósképző Akadémia támogatja.

Témavezető: Prof. Dr. Virág László és Dr. Demény Máté Ágoston