OETDK.

The study of the organellar genome (i.e., the mitochondrion and plastids) contributes to  understanding evolutionary relationships between species and organellar dysfunction by mapping deleterious point mutations and heteroplasmy. Second- and third-generation sequencing methods, particularly a genome skimming approach, are used to study organelles, but analyzing organelle genomes is not always trivial. This study discusses the characteristics of different approaches using both second (Illumina) and third-generation sequencing (Oxford Nanopore). The first experiment uses publicly available data to investigate the difference in nuclear and organellar genome coverage for a total of eight model species (Arabidopsis thaliana, Caenorhabditis elegans, Cucumis melo, Drosophila melanogaster, Homo sapiens, Oryza sativa, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe). Further experiments rely on simulated sequencing libraries based on the ratio between organellar and nuclear genome coverage and the error profile of the sequencing platforms. We also investigated the efficiency of organellar genome identification after de novo assembly for both sequencing platforms and using hybrid assembly (i.e. using short and long reads in the same assembly), using SPAdes and GetOrganelle, flye and UNICYCLER. In addition, we created species-specific k-nearest neighbor (kNN) models to identify reads before assembly. We also investigated the applicability of neural network (NN) models for the species Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. The length of the sequences in the training datasets was similar to that of the real sequencing libraries. Although the kNN-based identification was found to be relatively accurate, the time required for the complete analysis, including classification, was several times higher, especially for large genomes. Although the training of the NN models required more resources, the total time needed for the complete analysis was significantly reduced. For species with a high proportion of NUMTs (nuclear mitochondrial DNA), the NN model performed worse than kNN. Regardless of the method, identification of reads resulted in more continuous assemblies than assembly using all reads, with nearly 100% of the reference genome reconstructed with high accuracy. After further optimization, the presented methods could form the basis for a platform for accurate assembly and in-depth analysis of organellar genomes.

Témavezető: Dr. Laczkó Levente és Váradi Alex

Antibiotic-resistant bacteria are a significant threat to public health and detecting them in environmental samples is crucial. Their prevalence is intertwined with human, animal, and environmental factors, One Health recognises this global impact. Next-generation sequencing is highly effective in resolving outbreaks, tracing transmission routes, and understanding how antibiotic-resistant genes spread and evolve.  In this study, we examined the impact of the anthropogenic activities on antibiotic resistance genes in bacteria at three spots of the Berettyó River: Kismarja, Berettyóújfalu, and Bakonszeg, in Hungary. The bacterial samples were isolated from invertebrates. Antibiotic testing was conducted to identify and select antibiotic-resistant samples. Nanopore sequencing technology was used to accurately identify the bacterial strains. The sequences were assembled de novo and analyzed for antibiotic resistance genes, in particular the ESBL (Extended-spectrum β-lactamase) genes.  Out of the total number of samples obtained (n=499), 20.8% were identified as Escherichia coli, and 21.2% as Klebsiella pneumoniae. Of these samples, 200 were sequenced, of which 42.5% corresponded to E. coli and 29.0% K. pneumoniae. With the sequencing data, the 17 plasmids found in the samples analyzed were examined, which contained the ESBL genes. The IncFIB(K)_1_Kpn3 plasmid, which was present in 22.5% of the samples, and the IncI1_1_Alpha plasmid, which was present in 15.7% of the samples, stood out. Finally, the most frequently occurring ESBL genes were the CTX-M-15 gene, which was present in 46.6% of the samples, followed by the CTX-M-3 gene, which was present in 9.3% of the samples.  K. pneumoniae and E. coli are bacteria that cause community and hospital-acquired infections. They are becoming increasingly resistant to antimicrobial drugs, pose a major public health challenge. Cefotaximase-Munich (CTX-M)-type ESBL are emerging in these bacteria, leading to multidrug-resistant strains, especially in urinary tract infections. The influence of the population density in the Antibiotic Resistance Genes is notorious, after Berettyóújfalu, more ESBL genes were found. Analyzing antibiotic resistance genes is crucial to understand how resistance spreads and develop strategies to prevent its spread in the population. 

Témavezető: Dr. Freytag Csongor

Abstract Background:  Retinoic acid receptors (RARs) and vitamin D receptor (VDR) are nuclear receptors that form heterodimers with RXR and regulate the expression of multiple genes. Thus, many genes are regulated by both RAR and VDR agonists (e.g. AM850 and 1α,25-dihydroxyvitamin D3, respectively) in multiple cell types. Their combined treatment, particularly in cancer therapies, produces beneficial and additive effects. Among the regulated genes are primary target genes, which are directly regulated by the activated receptors. These genes are activated shortly after treatment (within a few hours) and do not require the synthesis of novel proteins for their induction Aim: This study seeks to examine genes regulated by both AM850 (RARα specific agonist) and 1α,25-dihydroxyvitamin D3 (VDR agonist) in differentiated THP-1 cells focusing on mRNA induction kinetics and additive effects on gene activation Methods: Using previous RNA-seq data (THP-1 cells were stimulated with RARα and VDR agonists) we identified three gene sets based on fold induction, specificity and significance. We selected representative genes for each set (DHRS3 and PTGES for RAR-specific, TGM2, HBEGF, and FBP1 for common, CLMN and CAMP for VDR-specific) and designed qPCR primers for them via NCBI primer designing tool for subsequent analyses. For gene expression analyses, we cultured THP1 cells in supplemented RPMI-1640 and induced THP1 differentiation into macrophages by PMA treatment. Following a 16-hour incubation, we treated the cells with vehicle (DMSO: Ethanol), 100 nM AM580, 100 nM 1α,25-dihydroxyvitamin D3 or a combination of both for 6 hours. For qPCR measurements, we extracted total RNA, synthesized cDNA and performed RT-qPCR using Cobas PCR instrument (Roche). Results: From our analysis, we found that commonly regulated genes were induced by both agonists within 2-3 hours. We confirmed the specificity of gene activation at earlier time points, ruling out the transient regulation by the other agonist. Conclusion: RT-qPCR results confirmed the RNA-seq data, verifying the shared up-regulation of specific genes by both VDR and RAR agonists. Combined treatment showed increased induction, indicating collaborative genomic effects of RAR and VDR. The analysis revealed additive effects on transcription in some genes and antagonistic effects in others. In our ongoing study, we aim to investigate whether RAR and VDR regulate the expression of the common genes by binding to the same enhancers.

Témavezető: Dr. Szeles Lajos

Lung cancer is one of the leading causes of cancer-related deaths worldwide. Brain metastasis is a common complication in patients with lung adenocarcinoma, significantly impacting survival rates and quality of life. Despite advances in diagnosis and treatment, the prognosis for patients with lung adenocarcinoma-related brain tumors remains poor, primarily due to late-stage diagnosis. Therefore, there is an urgent need to identify reliable biomarkers that can aid in the early diagnosis of lung adenocarcinoma-associated brain tumors. Since deregulation of miRNAs has been implicated in tumorigenesis and metastasis, making them attractive candidates as diagnostic and prognostic markers. We aimed to compare the miRNA expression pattern in malignant tissue samples  with lung adenocarcinoma-associated brain tumors and control brain tissue samples from healthy individuals, to  develop a miRNA panel that can help reliably distinguish between tumor and healthy samples, potentially serving as biomarkers for adenocarcinoma-associated brain tumors. Total RNA isolation from tissue samples was carried out using the miRNeasy Mini Kit (Qiagen). Next-generation sequencing (NGS) was performed using the Illumina NextSeq 500 sequencing device. The normalized data were analyzed using the iDEP.96 program. Validation of significantly over- and under-represented miRNAs in metastasis was performed using real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) with the miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen). Bioinformatics analysis involved filtering miRNAs with significant differences using the Mann-Whitney U test, and target genes of selected miRNAs were determined using miRTargetLink 2.0. Diagnostic efficiency was characterized using ROC analysis with the Easy ROC program. Following bioinformatics analysis of normalized data from NGS, two miRNAs, hsa-miR-200c-5p and hsa-miR-141-5p, were identified as significantly upregulated in adenocarcinoma-associated brain tumor samples compared to control samples. RT-qPCR validation confirmed the significant difference in expression levels of these miRNAs and the diagnostic efficiency of these miRNAs was successfully verified. In conclusion, the identification of hsa-miR-200c-5p and hsa-miR-141-5p as potential biomarkers for lung adenocarcinoma-associated brain tumors opens avenues for early diagnosis of metastatic brain tumors from lung adenocarcinoma and to distinguish it from other brain tumors.  

Témavezető: Dr. Hádáné Bírkó Zsuzsanna és Torner Bernadett

The process by which mesenchymal stem cells differentiate into mature chondrocytes is called chondrogenesis. Cartilage tissue consists of chondrocytes and a highly specialized extracellular matrix (ECM). During cartilage differentiation, the resulting ECM undergoes a dynamic transformation where different mechanical stimuli are essential for physiological development. However, current understanding of how a reduced gravitational field impacts articular cartilage homeostasis is rather limited. In our research, we focused on how global gene expression patterns are affected by simulated microgravity in chondroprogenitor cells differentiating in vitro at key stages of cartilage formation. Chondrifying primary micromass cultures were established from distal parts of limb buds of chicken embryos. Cultures were exposed to microgravity (zero g-force) by a random positioning machine (RPM 2.0; Airbus) for 96 hours at culture days 0–3 or culture days 3–6 of chondrogenic differentiation. Culture morphology was assessed by dimethyl methylene blue staining. Gene expression signatures were analysed using next generation RNA sequencing. There were 23 differentially expressed genes (DEGs) in cultures that experienced microgravity during the early stages of chondrogenesis, with 15 downregulated and 8 upregulated DEGs. In contrast, 56 DEGs were detected in cultures that were exposed to microgravity at later developmental stages, of which 40 were downregulated but only 16 were upregulated versus the control. Reactome analysis revealed that pathways related to apoptosis, potassium homeostasis and metabolism were enriched in cultures exposed to microgravity. Our results provide a detailed RNA expression analysis on the effects of simulated microgravity in primary chondrogenic cultures. Identifying specific pathways affected by microgravity may offer a better understanding of how cartilage regeneration may take place during spaceflights in the foreseeable future. Financial support: Young Researcher Excellence Programme (FK-134304) of the National Research, Development and Innovation Office. Supported by the Bolyai János Research Fellowship of the Hungarian Academy of Sciences. Supported by the New National Excellence Program of the Ministry for Culture and Innovation from the source of the National Research, Development and Innovation Fund, UNKP-23-5-DE-487, UNKP-23-4-II-DE-378 and UNKP-23-3-II-DE-13. Founded by the TKP2020-NKA-04 (DE-SPACE) grant.

Témavezető: Dr. Patrik Kovács és Dr. Csaba Matta

Oxidatív stressznek nevezzük azt a jelenséget, amikor a sejtekben termelődő reaktív oxigén gyökök (ROS) mennyisége, és az azokat elimináló antioxidáns folyamatok közötti egyensúly felborul. A tumorsejtekre jellemző magasabb ROS szint ugyan hozzájárulhat a daganat növekedéséhez, de egy bizonyos szint fölött sejthalált indukál. Ezért az oxidatív stresszt kiváltó kezeléseket ígéretes terápiás stratégiaként tartják számon. Célunk humán ovárium sejtvonalak oxidatív stressztűrő képességének vizsgálata volt. A PEO1 és az A2780 sejtvonalakkal dolgoztunk. Az oxidatív stresszt H2O2 kezeléssel (1-100 µM) váltottuk ki, majd meghatároztuk a sejtvonalakban mérhető ROS felszabadulás, sejtproliferáció, ill. a sejtlízis mértékét. A génexpresszió változását qPCR-rel detektáltuk. Végül a PEO1 sejtvonalat miR-30d-5p mimikkel transzfektáltuk és megvizsgáltuk a H2O2-vel szembeni toleranciájának változását. Eredményeink alapján a két sejtvonal H2O2-al szembeni toleranciája jelentősen eltért. Míg a PEO1 sejtvonalban a sejtproliferáció 40µM dózistól csökkent, addig ez az A2780-ban már 10µM kezelés esetén is megfigyelhető volt. Emellett az A2780 sejtvonalban 40 µM H2O2 hatására intenzív sejtlízis zajlott le. A H2O2 kezelés koncentráció függő módon intenzív ROS felszabadulást indukált mindkét sejtvonalban, amelynek mértéke nem tért el. Az antioxidáns folyamatokhoz köthető GPX4, FOXO3, CAT és SOD2 gének nem mutattak indukciót körülményeink között, azonban az EGR1, stressz válaszban is közreműködő növekedési regulátort kódoló gén indukciója volt jellemző a PEO1 sejtvonalban. A PEO1 miR-30d-5p – a PI3K/AKT útvonal szabályozásában közreműködő tumor szupresszor miRNS - mimikkel való transzfektálása csökkentette a PEO1 H2O2-al szembeni toleranciáját, mivel már 1 µM kezelés hatására a proliferációs képesség csökkenését tapasztaltuk. Eredményeink alapján a PEO1 és A2780 sejtvonalak oxidatív stresszel szembeni toleranciája jelentősen eltér. Ebben szerepe lehet az A2780-ban jelenlévő PTEN mutációnak. A miR30d-5p mimik oxidatív stresszt kiváltó ágensekkel kombinálva ígéretes terápiás alternatíva lehet petefészekrákban. A munka az NTP-NFTÖ22-B-0109 és az NKFIH-FK138021 projekt keretében valósult meg.

Témavezető: Dr. Szilágyi-Bónizs Melinda és Beke-Varga Alexandra

A petefészekrák a nőgyógyászati daganatok legsúlyosabb formája, melynek hajlamosító tényezői között szerepel az ösztrogéneknek való kitettség. Az ösztrogénválasz szabályozásában maghatározó a miRNS-ek szerepe, melyek tumorok növekedésében és terjedésében közreműködő kis, nem-kódoló RNS molekulák. Korábbi vizsgálatainkban az ösztrogénkezelésre érzékeny, és nem érzékeny ovárium sejtek miRNS mintázata nagymértékben különbözött. Munkánk célja ezen jelenség hátterének megértése.  Vizsgálatainkhoz a PEO1 (ösztrogén receptor α [ERα] pozitív, ösztrogén érzékeny] és A2780 (ERα negatív, nem ösztrogén érzékeny) humán epiteliális ovárium sejtvonalakat alkalmaztuk. A 2 sejtvonal globális miRNS mintázatát miRNS szekvenálással hasonlítottuk össze (Illumina Nextseq500). Az azonosított miRNS-eket bioinformatikai analízisnek vettettük alá az iDEP és miRNet alkalmazások felhasználásával. Ezt követően 19 miRNS expresszióját qPCR-rel is meghatároztuk. Eredményeink alapján a PEO1 sejtvonalban 262, az A2780-ban pedig 255 miRNS rendelkezett számottevő expresszióval (FPKM≥1). Ezek közül 186 expresszálódott mindkét sejtvonalban. Az expresszió mértékében való eltérést log2FC értékekkel jellemeztük, mely alapján 102 miRNS mutatott magasabb expressziót a PEO1 és 106 miRNS az A2780 esetében (log2FC>1). Az expresszióban leginkább eltérést mutató, TOP20 miRNS mindkét sejtvonalban kiterjedt hálózatok kialakítására volt képes, melyben kiemelkedő szerep juthat a let-7b-5p-nek (PEO1) és a miR-1-3p-nek (A2780). A géndúsulási analízis alapján target génjeik számos, a sejtciklushoz, sejthalálhoz, valamint a szteroid hormonok hatásmechanizmusához köthető folyamatokban is dúsulást mutattak. A validálásra kiválasztott 19 miRNS qPCR-rel meghatározott expressziója jól korrelált a szekvenálási adatokkal (r=0,92). Sikerült több miRNS-t azonosítanunk, amelyek nagyobb expresszióval rendelkeznek az ösztrogén érzékeny PEO1 sejtvonalban. Ezek további vizsgálata hozzájárulhat az ovárium sejtek ösztrogén válaszának megértéséhez, valamint az ovárium tumorok ösztrogén érzékenységének diagnosztizálását lehetővé tevő biomarkerek azonosításához. A munka az NKFIH-FK138021 projekt keretében valósult meg.

Témavezető: Dr. Szilágyi-Bónizs Melinda és Dr. Márton-Deme Éva

Tóth Gabriella Ilona, Molekuláris Biológia MSc II. évfolyam Debreceni Egyetem, Általános Orvostudományi Kar, Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet   A plazmidkromatinizáció vizsgálata emlős sejtekben   A plazmidok bakteriális eredetű, cirkuláris, duplaszálú DNS vektorok, melyek évtizedek óta a molekuláris biológia eszköztárának alapvető részei, és alkalmasak tetszőleges exogén fehérjék termeltetésére osztódó emlős sejtekben, ami lehetővé teszi többek között génterápiás alkalmazásukat is. A plazmidok emlős sejtekbe juttatásuk (transzfekció) után, a sejtosztódások során bekerülnek a sejtmagba, ahol hamar kromatinizálódnak, tehát felveszik a nukleoszóma szerkezetet, az viszont nem ismert, hogy ez hogyan hat az általuk hordozott gének kifejeződésére. Bizonyos források szerint a kromatinizálódott plazmidok hatékonyabban fejezik ki a géneket, mint a „csupasz” plazmidok, árnyalja viszont a képet, hogy a dinamikus, lazább kromatinszerkezetű plazmidok hatékonyabb génkifejeződést eredményeznek. Bár a nukleoszómák kialakulása a plazmidokon bizonyított, gyakoriságuk és elrendeződésük nem ismert. E kérdések megválaszolásához ATAC-seq adatok feldolgozásával vizsgáltuk a plazmidok, kromoszómák és mitokondriumok kromatinnyitottságát transzfektált emlős sejtekben. Az ATAC-seq kísérletek a kromatin transzpozáz általi hozzáférhetőségének kimutatására szolgálnak, a belőlük nyert újgenerációs szekvenálási adatok pedig lehetővé teszik a nyitott, nukleoszómáktól mentes kromatinrégiók feltérképezését. Munkánk során humán embrionális vese (HEK293T) sejtekbe és egérből származó indukált pluripotens őssejtekbe (iPS) transzfektált peroxiszóma proliferátor-aktivált receptor gammát (PPARG) kifejező és PPARG-t nem tartalmazó plazmidokat vizsgáltunk. Bioinformatikai elemzéseink alapján a plazmidok és mitokondriumok nyitottságát sok nagyságrenddel nagyobbnak találtuk a kromoszómák nyitottságához képest, ami részben a kópiaszámmal, részben a kromatinszerkezettel magyarázható. A relatív kópiaszámokat a kromoszómák elérhető maximális nyitottsága segítségével megállapítva arra jutottunk, hogy a plazmidok nagymértékű nyitottságát a nukleoszóma szerkezet hiánya, vagy az esetlegesen jelenlévő kisszámú nukleoszóma elhelyezkedésének a véletlenszerűsége okozza. Mivel a nukleoszómák megfelelő pozícionálása elősegítheti a gének kifejeződését, megközelítésünk és eredményeink hozzájárulhatnak a hatékonyabb fehérjetermeltetéshez akár a génterápia területén is.   Témavezető: Dr. Nagy Gergely

Témavezető: Dr. Nagy Gergely

Munkacsoportunk korábbi kísérletei során humán epidermális melanociták és melanóma sejtek sejtfelszíni fehérjéit izolálta. Azonban a protemikai és in silico megközelítéssel azonosított fehérjék között feltűnően nagy arányban szerepeltek olyan fehérjék, amelyek az exoszóma membránokhoz voltak köthetőek. Ezért munkánk céljául tűztük ki, hogy pontosabban feltérképezzük az egészséges és daganatos pigmentsejtek ún. exoszóma membranome-ját. Vizsgálatainkhoz humán bőrből izolált melanocita sejtkultúrából, valamint in situ (WM35), illetve invazív melanómából (A2058) létrehozott sejtvonalakból kinyert, főként sejtfelszíni fehérjéket tartalmazó proteomikai adatokból indultunk ki. Az exoszóma membranome fehérjéket a Uniprot adatbázis GO annotációi segítségével szeparáltuk az adatbázisainkból. Ezt követően a három sejtpopulációból kinyert adatokat összehasonlítottuk egymással, majd az így meghatározott, klinikai relevanciával bíró csoportok fehérjéit keresőszavak segítségével funkciók szerint karakterizáltuk. Az exoszóma membránfehérjék aránya 65,4% volt a melanocita, 59,7% a WM35 és 54,5% az A2058 melanóma sejtek mintáiban, míg azonos keresési paraméterekkel a teljes proteome-ban ugyanez az arány mindössze 12,2%-ot tett ki. A pigmentsejtek exoszóma membránfehérjéinek komparatív analízise eredményeként 120 proteint határoztunk meg melanocitákhoz köthetőként, míg 215 fehérjét kizárólag melanóma sejtekhez tudtunk társítani, továbbá 130 olyan fehérjét is azonosítottunk, amelyek mindhárom kultúrában kimutathatóak. Az előbbi két csoport diagnosztikai, az utóbbi pedig prognosztikai jelentőséggel rendelkező proteineket tartalmazhat. Ezen csoportok funkcionális elemzése alapján meghatároztuk a transzporterek, enzimek, receptorok, adhéziós és egyéb funkciójú fehérjék arányait is. A STRING adatbázison alapuló Cytoscape szoftver segítségével ’onko-omikai’ megközelítéssel tanulmányozhatunk klinikai szempontból érdekes exoszóma membránfehérjéket. A kiértékelés jelenleg még folyamatban van, azonban a módszer lehetőséget biztosít egy-egy fehérje más exoszóma membranome komponensekkel alkotott kapcsolati hálójának feltérképezésére. Munkánk során meghatároztuk a humán epidermális melanocitákhoz, valamint az in situ és az invazív melanóma sejtekhez köthető exoszóma membranome-ot. Ezen onkológiai szempontból érdekes fehérjék komparatív és funkcionális analízise, illetve hálózatbiológiai vizsgálata exoszómákhoz köthető, klinikailag releváns biomarkerek felfedezését segíthetik elő.

Témavezető: Dr. Hajdú Tibor és Dr. Kovács Patrik