OETDK.

Specialized metabolites, which are produced by fungi, are essential to their reactions to stress. These substances are key effectors in many interactions with host plants and other microorganisms - specialized metabolites have inhibitory or stimulatory influence on plant development. In our experiments, we tested the hypotheses if soil fungi and endophytes behave differently when interacting with a host plant, and, to the presence of a same-niche or different-niche competitor. Response is quantified through changes in the metabolome of the fungal cultures. Endophytes from Brassicaceae plants and soil fungi were used for the experiments. All chosen species belong to the genus Fusarium to reduce inter-strain variability. Young radish (Raphanus sativus, Brassicaceae) sprouts were used as plant inoculum. In brief, strains were grown on a shaker in minimal liquid medium in Erlenmeyer flasks in darkness. Before the onset of the stationary phase (determined by dry weight growth in preliminary experiments), either a competitor (a soil fungus, or an endophyte), or a living plant was added to the cultures. After 3 days, the culture was harvested by centrifugation, lyophilized, reduced to powder and extracted for evaluation by LC-MS/MS-based untargeted metabolomics. Features were annotated via deep-learning algorithms at compound class level. Based on state-of-the-art quality assurance metrics for metabolomics, 227 features met inclusion criteria for bioinformatics analyses. Up to now, 49 features were annotated, showing a coverage for mostly primary metabolites, but also including some alkaloids and terpenoids. Despite the taxonomic homogeneity, most features were present at highly variable levels in different strains, therefore, all data were normalized to that of levels in controls and pooled. With this scheme, 47 of 227 features showed different behavior when the effects on plant addition were examined via Kruskal-Wallis test. Interestingly, 15 features in endophytes showed significant changes upon plant addition and not in soil fungi, while in 32 features the opposite was found. Addition of competitor fungi resulted in much less changes in the metabolome, with 10 and 20 differentially changed metabolites found for endophytes and soil fungi. In conclusion, our results suggest the existence of metabolic biomarkers that might define a distinguished behavior of endophytic and soil fungi in their interaction with the plant or microbiome members.

Témavezető: Dr. Gonda Sándor

A humán feszültségkapuzott protoncsatorna (HV1) egy depolarizáció és pH által kapuzott protonszelektív ioncsatorna. A csatorna aktivációját követő extracelluláris térbe irányuló protonáramnak fontos szerepe van az immunsejtek membránpotenciáljának és pH-jának, illetve makrofágok citokin és szabadgyök termelésének szabályozásában. Bár korábban kimutatták, hogy a HV1 gátlása csökkenti a limfociták életképességét, különböző útvonalak mentén polarizált makrofágokban ilyen hatásokat eddig nem vizsgáltak. Ezért célul tűztük ki, hogy a polarizált makrofágok modellrendszerének kialakítása után megvizsgáljuk a HV1 gátlásának a sejtek életképességére gyakorolt hatását, valamint teszteljük a hatás csatorna specificitását és feltárjuk molekuláris hatásmechanizmusát. THP-1 monocitákat PMA segítségével M0 makrofágokká differenciáltattunk, majd ezt követően polarizáltuk a sejteket a klasszikus M1 (LPS és IFNγ), illetve az alternatív M2 (IL-4 és IL-13) útvonalon. A polarizáció sikerességét a sejtfelszíni CD marker profil (CD64, CD71, CD80, CD86, CD206) áramlási citometriás analízisével igazoltuk. Ezután megvizsgáltuk a HV1-et gátló kismolekula, az 5-kloro-2-guanidinobenzimidazol (ClGBI) és egyéb, ioncsatornákat gátló szerek (Zn2+, Vm24, tetraetil-ammónium és tetradotoxin) hatását a makrofágok életképességére a nekrotikus és apoptotikus sejtek Sytox Green, illetve annexin V markerekkel történő jelölése és a kettős negatív élő sejtek arányának áramlási citometriás meghatározása segítségével. A vizsgált kezelések közül a HV1 csatornát gátló ClGBI és Zn2+ csökkentette dózisfüggő módon a sejtek életképességét, továbbá a sejtek érzékenysége eltérőnek adódott a különböző makrofágokban (M1>M0>M2). További vizsgálataink alapján a ClGBI által kiváltott sejthalál ceramidfüggő, ugyanis áramlási citométeres méréseink során a kezelésre a membrán ceramid mennyisége szignifikáns mértékben megnőtt, míg a ceramid termelődését gátló szerekkel történő előkezelés (imipramin, GW4869 és myriocin) részleges védelmet nyújtott az életképesség csökkenése ellen. Eredményeink alapján THP-1 eredetű makrofágokban a HV1 gátlása polarizáció- és ceramidfüggő módon csökkenti a sejtek életképességét. Mivel feltételezéseink szerint a fokozott ceramidtermelésben szerepe lehet a pH szabályozás csatornagátlás következtében fellépő zavarának, a továbbiakban a ClGBI citoplazmai, lizoszómális és fagoszómális pH-ra gyakorolt hatásait tanulmányozzuk. OTKA FK143400, OTKA FK146740, ÚNKP-23-5-DE-488, ÚNKP-23-4-II-DE-169

Témavezető: Dr. Kovács Tamás és Dr. Zákány Florina

Bevezetés: A parlagfű pollen által kiváltott allergiás kórképek az egyik leggyakoribb szezonális megbetegedések, melyek prevalenciája egyre növekszik Magyarországon. A munkacsoport hosszú ideje egy egér modell segítségével vizsgálja az allergiás légúti gyulladások molekuláris mechanizmusát. Ebben a modellben az egerek szenzitizálásához a parlagfű pollen allergéneken kívül adjuvánsra is szükség van. Az alumíniumsók hatékony adjuvánsok, mivel az antigén lassan szabadul fel az oldhatatlan sórészecskék felszínéről, ami lehetővé teszi az immunrendszer hosszan tartó és hatékony stimulálását. Ezenkívül fokozzák a hivatásos antigén prezentáló sejtek migrációját és aktiválódását, így elősegítik a veleszületett és a szerzett immunválaszok kialakulását is. Célkitűzés: A munkacsoport által korábban használt és jól bevált adjuváns (Imject Alum) már nem elérhető a kereskedelmi forgalomban ezért kísérleteink során azt vizsgáltuk, hogy egy másik adjuváns (Alhydrogel) vajon képes-e a Th2 típusú immunválaszok hatékony stimulálására az egér modellünkben. Módszerek: Az Alhydrogel két koncentrációját is teszteltük (allergén/adjuváns: 1:1 és 3:1). Nyolc hetes BALB/c és C57BL/6 egereket Imject Alum vagy Alhydrogel adjuvánshoz adszorbeált parlagfű pollen kivonat (RWPE) intraperitoneális oltásával szenzitizáltunk a 0. és 4. napon. A 11. napon légúti gyulladást egyszeri intranazális RWPE kezeléssel váltottuk ki, míg a kontroll csoportokban az egereket foszfáttal pufferelt sóoldattal (PBS) kezeltük. Az intranazális kezelés után 3 nappal az egereket termináltuk és bronchoalveoláris lavage (BAL) mintákat gyűjtöttünk. A BAL mintákban meghatároztuk a teljes és a differenciál sejtszámot Wright-Giemsa festés és áramlási citometria segítségével. Eredmények: Az Alhydrogel alkalmazásával sikerült légúti gyulladást indukálni mindkét egértörzsben, amit eozinofil és neutrofil sejtek, valamint aktivált makrofágok jelenléte igazolt a BAL mintákban. A C57BL/6 egerek esetében a gyulladásos sejtek, különösen az eozinofil sejtek, bevándorlása a légutakba sokkal intenzívebb volt a kontroll csoporthoz képest, mint a BALB/c egereknél. Az Alhydrogel kisebb koncentrációban történő alkalmazása esetén lehetett a legtöbb gyulladásos sejtet kimutatni a BAL mintákban. A BALB/c egerek esetében több neutrofil és alveoláris makrofág volt a lavage folyadékban, mint a C57BL/6 egerekben. Eredményeink alapján az Alhydrogel-lel jól helyettesíthető lesz az Imject Alum a következő in vivo kísérleteinkben.

Témavezető: Prof. Bácsi Attila és Dr. Hajas György

Preface: Checkpoint inhibitor therapy targets immune checkpoints that regulate the immune system. CTLA4 and PDL-1 are the most commonly used checkpoint therapies. While they show promise in shrinking tumors and deactivating cancer cells, two-thirds of patients do not experience significant survival benefits due to the tumor-associated stroma (TAS) that forms around the tumor, creating a suppressive environment. Myeloid-derived suppressor cells (MDSCs) are one of the main factors in the development of TAS by inhibiting different types of T cells. The function of the Tks4 (tyrosine kinase substrate with 4 SH3 domains) adaptor protein in primary tumors and its effect on TAS and MDSC functions is not well understood.   Aims: Our research aims to gain a better understanding of the immunoregulatory functions of MDSCs and the role of Tks4 protein in the tumor microenvironment. Based on our experiments and preliminary results, we hypothesized that Tks4 enhances the tumor progression-enhancing inhibitory factors of TAS.   Methods: We differentiated MDSCs in vitro from the bone marrow of wild-type and Tks4-deficient mice models, or we directly isolated them from tumor-bearing mice of wild-type and Tks4-deficient using a flow cytometer. We assessed the immunosuppressive capacity of MDSCs by measuring T cell proliferation inhibitory activity and nitric oxide production.   Findings: We optimized the isolation of tumor- and bone marrow-derived MDSCs using flow cytometry and the measurement of T cell suppression. Our data suggests that MDSCs lacking Tks4 exhibit lower suppressive activity and that Tks4 is a tumor-promoting factor contributing to MDSC-mediated T-cell suppression and the development of efficient immunosuppressive factors. We demonstrated that significantly fewer tumors grew in Tks4-deficient (KO) mice than those having the Tks4 protein.   Interpretation T cell suppression occurs due to the presence of MDSCs and TAS development, which are connected to the TKS4 adaptor protein. As we continue to conduct more experiments and gather verifiable results, we believe that Tks4 could potentially be utilized as an experimental precision medicine tool and a clinical target for MDSC reprogramming. This could lead to an increase in the effectiveness of immunotherapies and personalized therapy.  

Témavezető: Dr. Lányi Árpád és Dr. Gyöngyösi Adrienn

A kiméra antigén receptorral (CAR) módosított T sejtek szinte kizárólagos autológ alkalmazhatósága hátráltatja klinikai onkoterápiás felhasználásukat. A természetes ölősejtek (NK) áthidalhatják ezt az akadályt, mivel a recipiens szervezetében nem váltanak ki graft-versus-host-betegséget, így allogén, „off-the-shelf” sejtkészítmény formájában alkalmazhatóak. Korábbi eredményeink alapján a HER2 tumor asszociált antigénre specifikus, a T sejtekre optimalizált kostimulációs endodoméneket kifejező CAR NK-92 sejtek in vivo hatása - jelentős in vitro aktivitásuk ellenére - átmeneti volt. Jelen kutatásunkban azt vizsgáltuk, hogy az NK sejtek jelátvitelében kulcsfontosságú 2B4 receptor intracelluláris doménjének CAR konstrucióba építése képes-e fokozni a HER2-CAR NK-92 sejtek tumorellenes válaszát. Kísérleteinkben második generációs HER2-CAR NK-92 sejtvonalakat hoztunk létre retrovirális transzdukcióval, amelyek intracellulárisan 2B4 (NK sejt specifikus), 41BB (T és NK sejt specifikus) vagy CD28 (T sejt specifikus) kostimulációs endodomént fejeztek ki. A sejtkészítmények in vitro hatékonyságát konvencionális immunológiai tesztekben, az in vivo citotoxikus hatást HER2+ xenograft modellben vizsgáltuk. Ebben NSG egereket 2 millió N87 (trastuzumab anti-HER2 antitestre érzékeny) tumorsejttel szubkután transzplantáltunk, majd két hét expanziót követően 5 millió CAR NK-92 sejttel kezeltünk. A tumorok méretét hetente monitoroztuk. Referenciaként, illetve a biológiai terápiákat reprezentáló antitest mediált citotoxicitást (ADCC) szimuláló kontrollként nem transzdukált NK-92 sejteket oltottunk trastuzumabbal együtt, vagy anélkül. Megállapítottuk, hogy az NK sejtekre specifikus 2B4-et és 41BB-t tartalmazó CAR-ok immobilizált HER2 target jelenlétében több interferon-gamma termelést, valamint erősebb citotoxikus hatást váltottak ki NK-92 sejtekben, mint a T-sejt specifikus CD28-CAR. Ugyanakkor, in vivo egyik CAR konstrukt sem tudott hatékonyabb tumorellenes választ kiváltani, mint a natív NK-92 sejtek trastuzumab jelenlétében. Eredményeink szerint az NK sejtekre optimalizált 2B4 és 41BB kostimulációval bíró CAR konstrukciók jobb in vitro hatékonysága nem érvényesül a xenograftok kifejlett tumor mikrokörnyezetében. A továbbiakban ezért az aktivált CAR-NK sejtekkel termeltetett bispecifikus T-sejt aktiváló molekulákkal (BiTE) próbáljuk a tumor mikrokörnyezetben lévő tumorinfiltráló T limfociták (TIL) specifikus tumorellenes hatását fokozni a hatékonyabb terápia érdekében.

Témavezető: Dr. Szöőr Árpád és Gergely Bence

A sejthalál módja közvetlen hatással van mind a veleszületett, mind az adaptív immunválaszra, elsősorban a pusztuló sejtekből felszabaduló faktorokon, a sérülés asszociált DAMP-okon és a szövet rezolúció asszociált RAMP-okon keresztül. Az elmúlt években több szabályozott sejthalál útvonalat írtak le, amelyek nekrotikus kimenetűek, a sejtmembrán integritásának elvesztése vezet a sejtek pusztulásához. Ezek közé tartozik a nekroptózis, a piroptózis és a ferroptózis is. Az egyes sejthalál útvonalak eltérő jelpályái jól jellemzettek, de immunológiai kimenetük különbségeit még nem vizsgálták szisztematikusan. A kutatásunk során vizsgáltuk az apoptózis, nekroptózis, piroptózis és a ferroptózis hatását a természetes immunrendszer sejtjeire. A sejthalál formákat az egyes sejthalál folyamatokat specifikusan aktiváló ligandok felhasználásával indukáltuk primer humán makrofágokon, illetve MDA, Jurkat és THP-1 sejtvonalakon. A sejthalálok hatását tanulmányoztuk pro- és anti-inflammatorikus (M1, illetve M2) makrofág alpopulációk differenciációjára és funkcióira. A kutató munka során monocita szeparálást, sejtdifferenciáltatást és szövettenyésztést végeztünk. A sejthalál mértékét áramlási citometriával határoztuk meg. Azonos sejthalál intenzitás mellett vizsgáltuk a különféle módokon elölt sejtek felülúszójának hatását humán monocitából differenciáltatott pro-, és anti-inflammatorikus makrofág alpopulációkra, majd ELISA módszerrel detektáltuk a pusztuló sejtek felülúszójával kezelt M1 és M2 makrofágok TNF-α, IL-6, IL-8, IL-12 és IL-10 citokin termelését. A kutató munka során sikeresen beállítottuk a négy féle sejthalált makrofágokon, valamint a THP1, MDA és Jurkat sejtvonalakon. Eredményeink szerint a piroptózis intenzívebb IL-1β termelést indukált a kezelt makrofágokban, mint a többi sejthalál forma. A piroptózis és a nekroptózis magasabb TNF-α és IL-12 termelést eredményezett, mint az apoptózis és a ferroptózis; a piroptózis, a nekroptózis és a ferroptózis pedig magasabb IL-6 termelést, mint az apoptózis. Az antiinflammatórikus IL-10 termelése az apoptózis és ferroptózis esetében intenzívebb volt, mint a nekroptózis és piroptózis esetén. Az eredményeink azt mutatják, hogy a különböző nekrotikus sejthalál folyamatok során felszabaduló faktorok eltérően aktiválják a makrofágokat, amivel a természetes immunválasz gyulladási folyamatainak többféle kimenetét teszik lehetővé.

Témavezető: Dr. Koncz Gábor és Kardos Balázs

A magas onkogén kockázatú humán papillomavírusok (HPV) által okozott fertőzések tekinthetők a legfontosabb etiológiai faktornak a méhnyakrák, az egyéb anogenitális daganatok, valamint a fej-nyaki régióban megjelenő tumorok jelentős részében. A HPV-asszociált tumorok létrejöttéhez és progressziójához a HPV E7 onkoprotein hatása elengedhetetlen. Ez a vírusfehérje számos, a gazdasejt túlélését, proliferációját és migrációját szabályozó proteinnel képes kölcsönhatásba lépni. Ezen kapcsolatok jellemzése kulcsfontosságú lehet a HPV okozta tumorok korai prognózisában és célzott terápiájában. A tumorszupresszor PTPN14 citoplazmatikus protein tirozin foszfatáz az E7 kölcsönható partnere, és a „high-risk” HPV E7 a PTPN14 degradációját okozza. Habár a PTPN14 szerepe ismert a Hippo jelátviteli útvonal szabályozásában, azonban az erős E7-PTPN14 asszociáció jelentősége még nem teljesen tisztázott. Munkacsoportunk korábbi kísérletei során kimutatta, hogy a PLK1 mitotikus regulátor fehérje szintén kötődhet az E7 onkoproteinhez. Kutatásunk célja a PTPN14-E7 interakció hatásának vizsgálata a PLK1 expressziójára. HPV negatív, illetve HPV genomot hordozó sejtvonalakban; továbbá in vitro kísérletes modell rendszerekben - HPV E7 exogén expresszió alkalmazásával, valamint HPV-18 pozitív HeLa és HPV-16 pozitív CaSki sejtvonalak E6, illetve E6/E7 specifikus siRNS kezelésével – vizsgáltuk a PTPN14 által befolyásolt onkogén jelátviteli pálya elemeinek expresszióját szemi-kvantitatív Western blot analízissel, immunfluoreszcencia alkalmazásával, pull-down módszerrel és valós idejű PCR technikával. Eredményeink azt mutatták, hogy a Hippo szignalizációs útvonal aktivitásában szerepet játszó LATS1 fehérje az E7-PTPN14 komplexben jelen van. A magas onkogén kockázatú HPV E7 jelenlétében a LATS1 által szabályozott miozin foszfatáz regulátor alegység MYPT1 expressziója csökkent, ezzel szemben a MYPT1 által szabályozott PLK1 mennyisége pedig megemelkedett. Ezen felül immunfluoreszcens festés alkalmazásával az is kimutatható, hogy a MYPT1 sejten belüli eloszlása is jelentősen megváltozik az E7 hatására. A génexpressziós vizsgálatok egyértelműen arra utaltak, hogy a megfigyelt jelenségek oka a fehérjék stabilitásának változása. Vizsgálataink alapján a PLK1 mitotikus regulátor fehérjét, mint potenciális PTPN14 targetet azonosítottuk, tehát a PTPN14-E7 interakció hozzájárulhat a HPV fertőzött sejtek fokozott mitotikus aktivitásához

Témavezető: Dr. Szalmás Anita

Bevezetés A makrofágok (MF) az öröklött immunrendszer részeként hatékonyan képesek a szervezet számára veszélyes, idegen eredetű mikrobákat és anyagokat eltávolítani. A MF polarizáltságukat tekintve M1 és M2 polarizációs végpontok közötti állapotot vehetnek fel, ahol a polarizáltsági állapotot a MF mintázat-felismerő receptorainak (Pattern Recognition Receptor, PRR) stimulációja és a MF-polarizáló interleukin-4 (IL-4) és interferon gamma (IFNg) citokinek jelenléte határozzák meg. Szakirodalmi ismeretink szerint a MF felerősített gyulladásos válaszát irányító transzkripciós folyamatok az IFNg és PRR-ok aktiválta klasszikus, illetve az IL-4 és PRR-ok indukálta kiterjesztett szinergisztikus jelátviteli folyamatok útján jöhetnek létre. A MF-ban megjelenő BACH1 egy kromatinhoz kötött, hem szenzorként ismert transzkripciós represszor és a legújabb eredmények szerint képes a MF gyulladásos válaszát szabályozni. A kísérleteink célja, hogy felmérje a MF-ban megjelenő BACH1 szerepét a klasszikus és kiterjesztett transzkripciós szinergizmus során in vitro standard és immunszupresszív mikrokörnyezetben. Módszerek A csontvelő-eredetű MF-t kontroll és Bach1-knock out (KO) genotípusú egerek csontvelőiből tenyésztettük ki M-CSF jelenlétében. Az immunszupresszív környezet kialakításához 90% B16/F10 metasztatikus melanoma kondícionált tápfolyadékát és 10% standard tápfolyadék keverékét használtuk. Az 5. napon a sejteket 20 ng/mL IL-4 és IFNg-val kezeltük. A 24 órás priming után 3 órás kezelés történt lipopoliszachariddal. A kezelés után a sejtekből totál RNS-t izoláltunk, és qRT-PCR segítségével megmértük a klasszikus és kiterjesztett transzkripciós szinergizmus célgénjeinek relatív expresszióját. Eredmények A klasszikus szinergia vizsgálata során az Il6 és Tnfa citokin gének expressziója BACH1-dependens módon változott, amit a melanóma eredetű komponenseket tartalmazó mikrokörnyezet szintén képes modulálni. Hasonló BACH1-függő génexpressziós változásokat észleltünk a kiterjesztett szinergia során a Ccl22, Edn1 és az Il12a gének esetében. Az ismert, IL-4 citokin által represszált Cxcl10, Il10 és Il15 citokinek génjei szintén BACH1-függőek és az immunszupresszív mikrokörnyezet befolyásolta ezen gének megjelenését. Konklúzió Konklúzióként elmondható, hogy a BACH1 részt vesz a klasszikus és kiterjesztett transzkripciós programokban, amit a tumor eredetű immunszupresszív környezet szintén modulálhat.  

Témavezető: Dr. Nagy László és Dr. Bene Krisztián

A szöveti rezidens makrofág Hofbauer-sejtek (HB-sejtek) központi szerepet játszanak a méhlepény szöveti integritásának és homeosztázisának fenntartásában. A HB-sejtek felelősek a magzati oldal immunfunkcióiért, hozzájárulnak a chorionbolyhok angiogeneziséhez, regenerációjához és anyagcseréjéhez. Ezen szerepek mindegyike a várandósság lefolyását és kimenetelét – a méhlepény funkciójának teljesítésén keresztül – nagymértékben befolyásolja. Milyen szabályozó mechanizmusok biztosítják ezen sejtek egyedi génkifejeződését? Vannak-e alcsoportok a HB-sejtek eddig homogénnek gondolt populációjában? Programozhatók-e a HB-sejtek? Munkánk során ezen kérdésekre keressük a válaszokat. Projektünk során egészséges humán méhlepényekből izolált HB-sejteken végeztünk morfológiai (cytospin) és molekuláris biológiai vizsgálatokat (bulk RNA-Seq, ATAC-Seq). Ezen analízisek eredményeit bioinformatikai eszközök segítségével más makrofágok adataival hasonlítottuk össze. A HB-sejteket in vitro IL-4-gyel és a PPAR???? aktivátor rosiglitazonnal (RSG) kezeltük, a stimulációra mutatott génexpressziós változásokat pedig RT-qPCR segítségével vizsgáltuk. A HB-sejtek heterogenitásának feltérképezése érdekében CyTOF analízist és nyilvános adatbázisból single cell RNA-seq adatok értékelését is elvégeztünk. Vizsgálatunk során a HB-sejtekről cytospinnel készült képek pleomorf, de egységesen granulumokat és vakuolumokat tartalmazó homogén sejtcsoportot mutattak. A NUR77, RFX, GR transzkripciós faktorok HB-sejtekre specifikus nyitott kromatinrégiók és egyedileg kifejeződő gének szabályozóinak bizonyultak. A HB-sejtek génkifejeződési mintázata alátámasztja a funkciójukról (pl. angiogenesis irányítása) eddig alkotott képünket. A HB-sejtek IL-4 és RSG stimulációra egyedi génexpressziós választ mutattak. Tanulmányunk továbbá génexpressziós és proteomi szinten is HB-sejt alpopulációkat azonosított. Az anyai-magzati határfelület komplex, a várandósság alatt dinamikusan változó mikrokörnyezetét számos ponton homály fedi. A HB-sejteket ezen miliő egyik központi alkotóelemének tartjuk és eddigi eredményeink egy egyedi makrofág képét rajzolják ki. Az anyai és magzati oldal sejtes komponenseinek megismerése általános biológiai és orvosi szempontból egyaránt jelentős előrelépéseket hozhat. A jövőben a HB-sejtek terhességi komplikációkban (méhen belüli növekedési retardáció, preeklampszia, gesztációs diabétesz stb.) betöltött szerepét is hasonló megközelítéssel kívánjuk vizsgálni.

Témavezető: Prof. Nagy László

Bevezetés: A mezenchymális sztrómasejtek (MSC-k) regenerációt támogató és immunreguláló aktivitásuk révén a szöveti homeosztatikus állapot fenntartásának alappillérei. Ezen multipotens őssejtek jellemzőit (élet- és differenciációs képességét, szekréciós mintázatát, immunreguláló hatását) környezetük és az őket körülvevő immunogén/tolerogén szignálok együttesen határozzák meg. Ezek ismeretében, bizonyított terápiás hatékonyságuk, melynek növelése érdekében az MSC-ket megfelelő kondicionálással in vitro primingnak vetik alá. Célkitűzés: A sejthalálok immunreguláló hatása az intracelluláris térből felszabaduló inflammatórikus DAMP-oknak (damage associated molecular patterns) és rezolúcióhoz kötött megfelelőiknek (SMP) tulajdonítható. Erre alapozva feltételeztük, hogy különféle sejthalálformákat indukálva MSC-kben, módosítható az őssejtek egyébként is jelentős immunreguláló működése. Anyagok és módszerek: Az MSC-k apoptotikus, nekroptotikus, piroptotikus és ferroptotikus pusztulásának kiváltását, propidium-jodid jelölést követően, áramlási citometriával, a termelt mediátorok minőségi és mennyiségi meghatározását ELISA módszerrel végeztük. Az élő és halott MSC szekretom immunválaszra gyakorolt hatásának vizsgálatához, perifériás humán vérből izolált monocitaeredetű dendritikus sejteket (moDS) 24 órán át kezeltünk MSC felülúszóval, majd a sejteket 24 órás LPS/CL075 aktivációnak vetettük alá. Az moDS-ek sejtfelszíni marker expresszióját és T-sejt proliferációra gyakorolt hatását áramlási citometriával, citokintermelését ELISA módszerrel detektáltuk. Eredmények: Az irodalomban először, reprodukálható és koordinált módon sikerült kiváltanunk többféle őssejtpusztulást. Feltártuk a tanulmányozott négy sejthalálinducióval nyert MSC-felülúszó oldott mediátor tartalmának (SMP/DAMP, IL-6, IL-8, TGF-b) minőségi és mennyiségi eltéréseit. A leírt módon előkezelt, majd aktivált moDS-ek változást mutattak citokinszekréciójukban (IL-10, IL-12, IP-10, TNF-α), valamint fenotípusukban (CD80, HLA-DQ, CD40, PD-L1, CTLA-4, CD83, CD1a). Kiemelendő a csontvelői MSC-primingolt DS-ek CD80 és az ezt gátló CTLA-4 együttes expressziója. Továbbá, megállapítottuk, hogy a DS-ek eltérően befolyásolták a T-sejt proliferációt. Megbeszélés: Eredményeink indikátorai az élő és sejthalált szenvedett MSC-k immunmoduláló hatásának, tehát a sejthalálindukcióban rejlő potenciálnak, amely opcionális priming lehetőséget nyújthat az MSC-kre alapozott sejtmentes terápiák hatásfokának növelésében.

Témavezető: Dr. Türk-Mázló Anett és Dr. Koncz Gábor

A CAR T sejt terápiák elterjedését szolid tumorokban hátráltatja a sejtkészítmények rövid életideje és visszafogott perzisztenciája, melyet gyakran a checkpoint molekulák gátló hatása okoz. A tumor nekrózis faktor receptorcsaládba tartozó CD30 membránfehérje ligandkötést követően gátolja a T sejt mediált tumorellenes immunválaszt, így rontja a terápiás hatékonyságot. Kollaborátoraink előkísérleteikben igazolták, hogy a CEA (karcinoemrionális antigén) tumorasszociált antigént felismerő, egyben a CD30 molekulát gátló bispecifikus CAR T sejtek in vitro tumorellenes hatékonysága szignifikánsan magasabb, mint a konvencionális CEA-CAR T sejteké. Jelen kutatásainkban ezt a megfigyelést validáltuk in vivo xenograft és rechallenge modellekben. Kísérleteinkben primer humán T sejteket módosítottunk második generációs CEA-, illetve CD30/CEA-CAR konstruktokkal retrovirális transzdukciós rendszerben. A génmódosítás hatékonyságát áramlási citometriával validáltuk, ami a CEA-CAR esetén 50%, a CD30/CEA-CAR esetén 70% volt. A konvencionális, illetve bispecifikus CAR T sejtkészítmények in vivo citotoxikus hatását gyomorkarcinóma xenograft modellben vizsgáltuk, ahol NSG egereket 3 millió CEA+/CD30- N87 targetsejttel subkután transzplantáltunk, majd két hét inkubációt követően különböző dózisú effektorsejttel (250 és 500 ezer, illetve 1 millió) kezeltünk. A tumorok méretét, valamint az emittált lumineszcencia intenzitását heti két alkalommal kvantáltuk. Referenciaként nem transzdukált T sejttel kezelt csoport szolgált. Megállapítottuk, hogy míg a bispecifikus CD30/CEA-CAR T sejtek már a legkisebb dózisban alkalmazva is komplett és hosszantartó terápiás hatást értek el minden kezelt egéren, addig a konvencionális CEA-CAR T sejtek csak a legmagasabb dózisban (1 M) alkalmazva javították a túlélést szignifikáns mértékben a kontroll csoporthoz képest. A tumoroltást követő századik napon a gyógyult CD30/CEA CAR kezelt egereket CEA- MC38, illetve CEA+ C15A3 kolonkarcinóma sejtekkel újraoltottuk. Azt tapasztaltuk, hogy az újraoltást követően 3 héttel minden CEA- tumor túlnőtt, míg a CEA+ tumorok méretét a hosszan perzisztáló CAR T sejtek kontrollálták. Összegezve elmondható, hogy bár mind a CEA, mind a CD30/CEA CAR T sejtek potens in vitro tumorellenes hatást mutattak, in vivo csak a kettős támadáspontú CAR-ok voltak hatékonyak. Megfigyelésünk rámutat a CD30 molekula immunmoduláns funkciójára, így a gátlása releváns lehet a szolid tumorokat célzó CAR T sejtes terápiák fejlesztése során.  

Témavezető: Gergely Bence és Dr. Szöőr Árpád