OETDK.

Three types of adipocytes are distinguished: the energy-storing white, and the two thermogenic, brown and beige. The heat production of brown and beige adipocytes, which can be found majorly in the deep neck (DN) and paravertebral regions in human adults, is primarily activated by the sympathetic stimulus caused by cold exposure. In these cells, the mitochondrial uncoupling protein 1 (UCP1) uncouples the electron transport chain and ATP synthesis resulting in heat release. Inhibitors of DNA binding and cell differentiation (ID) proteins 1-4, classified within the helix-loop-helix transcription factor family, function as inhibitors of DNA binding and cell differentiation. In my research group, the sympathetic response of adipocytes to cold was modeled with a cell-permeable cAMP analog, which not only increased thermogenesis, but also the expression of the ID1, ID3, and ID4 genes. Therefore, we intended to investigate whether pharmacological inhibition of IDs influences the activation of human adipocyte thermogenesis by sympathetic stimulus ex vivo. Human primary neck subcutaneous (SC) and DN preadipocytes were differentiated for 14 days to adipocytes with high thermogenic capacity, then treated with dibutyryl-cAMP for 10 hours to mimic thermogenic stimulation in the presence or absence of a pharmacological pan-ID antagonist, AGX51. The expression of the ID, mitochondrial, and thermogenic genes and proteins was determined by RT-qPCR and Western blotting. Oxygen consumption and extracellular acidification of adipocytes was measured using a Seahorse XF96 Extracellular Flux Analyzer. Proton leak respiration that reflects thermogenesis was assessed after the injection of the ATP synthase inhibitor, oligomycin. We observed that the cAMP-stimulated elevation of proton leak respiration, extracellular acidification, mitochondrial complex I content, and expression of thermogenic genes and proteins (UCP1, PGC1A, DIO2, CITED1) was hampered by the pan-ID antagonist, which promoted the degradation of ID1 and ID3 proteins. Our results suggested that ID proteins, especially ID1 and ID3, play important roles for efficient thermogenic response during adrenergic stimulation in human neck derived adipocytes. The enhancement of non-shivering thermogenesis in brown and beige adipocytes can serve as a novel therapeutic target in the fight against obesity and diabetes.

Témavezető: Dr. Endre Károly Kristóf és Dr. Arianti Rini

The human pancreas secretes the major cationic and anionic trypsinogens, and the minor mesotrypsinogen into the intestine as inactive precursors. The proteolytic conversion of the major trypsinogens to active trypsins occurs by a self-catalytic reaction called auto-activation. Although mesotrypsinogen is highly homologous with the major trypsinogens, it is not capable of auto-activation. Intrapancreatic trypsinogen activation is restricted by proteolytic cleavages catalyzed by chymotrypsin C (CTRC), another pancreatic protease. The aim of our project is to characterize which evolutionary trypsinogen mutation is responsible for the abolished auto-activation of mesotrypsinogen in the absence and presence of CTRC. The bacterial expression plasmid carrying the coding DNA for cationic trypsinogen was readily available in our laboratory. Mesotrypsinogen specific missense mutations were generated with overlap extension PCR mutagenesis. Cationic trypsinogen was expressed in the aminopeptidase P deficient E. coli LG3 strain, in vitro refolded and purified with affinity chromatography. Trypsinogen activation in the presence and absence of CTRC was studied by activity assay using Suc-Ala-Ala-Pro-Lys-pNA as substrate. Proteolytic cleavages were followed by SDS polyacrylamide gel electrophoresis. The stained protein bands were quantitatively analyzed by densitometry. Sequence comparisons revealed 16 amino acid residues in mesotrypsinogen that are not present in any of the major trypsinogens. We have studied five cationic trypsinogen variants (Y45S, G62A, S67T, E79K, K102D) carrying mutations specific to mesotrypsinogen so far. When assayed in the absence of CTRC, the Y45S, E79K and K102D variants substantially decreased cationic trypsinogen auto-activation. In contrast, activation of the G62A and S67T variants was comparable with the wild-type. CTRC suppressed auto-activation of cationic trypsinogen by cleaving the calcium-binding loop. When assayed in the presence of CTRC, the E79K variant activated with a reduced rate but reached markedly higher final trypsin levels than the wild-type. Interestingly, all the other variants activated similarly to the wild-type in the presence of CTRC. The different characteristics of the E79K variant can be explained by its greater resistance to CTRC-mediated trypsinogen degradation. The results demonstrate that the combined effect of several mutations results in the inability of mesotrypsinogen to auto-activate.

Témavezető: Dr. András Szabó

Brown/beige adipocytes, which are enriched in distinct anatomical regions including the deep neck (DN) area in humans, express uncoupling protein-1 (UCP1) that enables them to dissipate energy as heat. Specific activation of this process can alleviate obesity. Our preliminary data showed that the expression of transferrin receptor (TFRC) in human neck derived adipocytes was induced during thermogenic activation by dibutyryl-cAMP, which mimics in vivo heat production. TFRC, as a transmembrane protein, plays critical roles in iron homeostasis and it is involved in various physiological and pathological processes by the formation of TFRC–transferrin–iron complex. Therefore, we aimed to unravel the importance of TFRC-mediated iron consumption for the efficient thermogenic response in human neck derived adipocytes. Stromal-vascular fractions were isolated from subcutaneous (SC) and DN adipose tissue biopsies and then they were differentiated to adipocytes for 14 days. During adrenergic-driven thermogenic activation by the cell permeable dibutyryl-cAMP, we treated the adipocytes with ferristatin II which promotes the degradation of TFRC. Iron concentration in the conditioned media was measured by spectrophotometry. The expression of TFRC, mitochondrial, and thermogenic genes and proteins was determined by RT-qPCR and Western blotting. Oxygen consumption of adipocytes was measured using a Seahorse XF96 Extracellular Flux Analyzer. Proton leak respiration that reflects thermogenesis was assessed after the injection of the ATP synthase inhibitor, oligomycin. We found that ferristatin II reduced TFRC protein expression in both SC and DN derived adipocytes. Activated adipocytes consumed more iron as compared to control ones as reflected by decreased total iron concentration in the conditioned media. Ferristatin II treatment prevented the cAMP-stimulated elevation of iron uptake along with the upregulation of thermogenic genes, such as UCP1, PGC1a, DIO2, CITED1, and PM20D1 and mitochondrial complex subunits I-IV. In accordance with the iron uptake and gene expression data, we also observed decreased maximal stimulated and proton leak respiration in the presence of ferristatin II, in both SC and DN derived adipocytes. Our results suggested that TFRC-mediated iron uptake is critical for efficient thermogenic response in human neck derived adipocytes.

Témavezető: Dr. Endre Károly Kristóf és Dr. Rini Arianti

A miozin foszfatáz (MP) PP1-típusú holoenzim, amelyben a PP1cδ katalitikus alegység miozinhoz is kötődő regulátor alegységhez (MYPT1) kapcsolódik. A miozin defoszforilációja - és ezáltal a simaizom kontrakció regulációja – mellett kimutatták a MP szerepét számos nem-kontraktilis sejtfolyamat, többek között a sejtciklus és a sejtosztódás szabályozásában, csökkent aktivitása pedig hozzájárulhat a daganatsejtek proliferációjához és metasztázisához. A MP gátlása részben a MYPT1 alegység T696 és T853 oldalláncainak foszforilációja által valósul meg. Ezen gátló helyek foszforilációját számos kináz katalizálhatja, míg a defoszforilációjukban (a MP aktiválásában) elsősorban PP2A holoenzimek szerepét feltételezik. A célrairányító regulátor B alegység(ek)et azonban eddig nem azonosították. Az epigallokatechin-gallát (EGCG) a PP2A és a MP koordinált aktivációját okozza a 67 kDa laminin receptor (67LR) → cAMP/PKA → PP2A → MP jelátviteli útvonalon keresztül. Korábban kimutatták, hogy a PKA a B56δ regulátor alegység foszforilációja révén fokozza a PP2A aktivitást idegsejtekben, ám ennek a foszforilációnak a szerepét az EGCG által indukált foszfatáz aktiválásban még nem vizsgálták. Jelen kísérleteink célja, hogy feltárjuk a B56 fehérjecsalád részvételét, valamint a MP holoenzimmel való interakciójukat az EGCG/67LR útvonalban. Az aminosav szekvenciák összehasonlításával megállapítottuk, hogy a PKA-foszforilációs helyet körülvevő szakasz a B56δ mellett a B56γ3 izoformában is jelen van. A B56 fehérjéket HEK293AD sejtekben overexpresszáltuk, majd a PKA aktivátor forskolinnal való kezelést követően foszfo-specifikus antitest alkalmazásával megvizsgáltuk az izoformák foszforilációját. Eredményeink alapján a B56δ és γ3 izoformák egyaránt foszforilálódnak PKA által. EGCG-kezelt sejtekben megvizsgálva a B56 fehérjék foszforilációját egy 61 kDa méretű fehérjesávot detektáltunk, ami vélhetően a B56γ3 izoformának felel meg. A MYPT1 és a B56 alegységek kölcsönhatásának vizsgálatához Flag-MYPT1 és HA-PP2A-B56α/γ3/δ alegységeket koexpresszáltunk HEK293AD sejtekben, és anti-Flag antitest használatával immunprecipitációt végeztünk. Mindhárom B56 izoforma detektálható volt a Flag-MYPT1 immunprecipitátumban, ami a kölcsönhatás lehetőségét igazolja ezen fehérjék között. Eredményeink a B56δ és γ3 alegységek szerepét sugallják a MYPT1 defoszforilációjában az EGCG/67LR útvonalban. Kutatásaink hozzájárulnak a foszfatáz holoenzimek együttműködésének feltáráshoz a jelátviteli folyamatokban.

Témavezető: Dr. Kiss Andrea

A transzglutamináz 2 (TG2) egyedülállóan sokoldalú fehérje. Többféle változatos katalitikus aktivitással rendelkezik, pl. transzglutamináz, PDI, GTPáz, protein kináz aktivitások, és mint interakciós partner többféle biológiai folyamatban is részt vesz. A TG2 szerepet játszik a sejtek apoptózisában és túlélésében, adhéziójában, migrációjában, az extracelluláris mátrix kialakításában és összefüggésbe hozható különböző tumoros, autoimmun és neurodegeneratív betegségekkel is. A humán köldökzsinór véna endotél sejtekben (HUVEC) fiziológiásan nagy mennyiségben megtalálható a fehérje, de szerepe az endotél sejtek funkcióiban, az érképzésben részletesen nem ismert. A TG2 interakciós partnereket kétféle koimmunprecipitációt követő LC-MS/MS analízissel azonosítottuk. Az eredményt STRING adatbázis és korábbi közlemények eredményével vetettük össze. A kísérleteink megbízhatóságát megerősítette, hogy korábban már publikált interakciós partnerek is voltak a találatok között (~5 %). A STRING analízis alapján, az „RNS-kötés” Gén Ontológia (GO) Molekuláris funkció dúsult a legnagyobb mértékben az interakciós partnerek között. Ez azt sugallja, hogy a TG2-nek szerepe lehet az RNS-kötő fehérjék szabályozásában. Célul tűztük ki a HUVEC sejtek RNS-kötő fehérjéinek meghatározását és a TG2 interakciós partnerekkel összehasonlítását. Az élő HUVEC sejtekben UV besugárzással stabilizáltuk az RNS-fehérje komplexeket és ezt követően ortogonális szerves fázis szeparációs eljárással izoláltuk az RNS-kötő fehérjéket, amelyeket LC-MS/MS analízissel azonosítottunk. A találatok tanulmányozása során kiderült, hogy a korábban azonosított TG2 interakciós partnerek fele szerepel a HUVEC RNS-kötő fehérjéi között. Sok átfedést találtunk a TG2 interakciós partnerek és az RNS-kötő fehérjék esetén feldúsult GO alapú csoportosítások definíciói között is. Ráadásul, a HUVEC sejtekből izolált RNS-kötő fehérjék között azonosítottuk a TG2 fehérjét, amit Western blottal is megerősítettünk. Ezután mágneses RNS-fehérje pull-down kisérlettel, egy 43-mer 3’-biotinilált RNS oligonukleotidot immobilizálva sikerült kimutatnunk, hogy a tisztított rekombináns TG2 fehérje képes kötődni az RNS molekulához. Eredményeink alapján a TG2 rendelkezik egy eddig nem publikált RNS-kötő sajátsággal, aminek a részletes karakterizálása folyamatban van. A TG2 RNS-kötő sajátságának a vizsgálata új utat nyithat a multifunkcionalitásának a megértéséhez. A kutatást az NKFIH K129139 projekt támogatta.

Témavezető: Dr. Király Róbert és Csaholczi Bianka

A jelátviteli molekulák foszforilációs és defoszforlizációs állapotának megfelelő aránya elengedhetetlen a sejt homeosztázisának fenntartásához. Ez az egyensúly protein kináz és foszfatáz enzimek által szabályozott. Ezen enzimek expressziós szintjének, illetve aktivitásának megváltozása a tumorgenezis és -progresszió kulcslépése. Az egyik ilyen onkogén jelátviteli útvonal a miozin foszfatáz (MP)/protein arginin metiltranszferáz 5 (PRMT5)/hiszton (H4) útvonal, amely a hiszton fehérjék szimmetrikus dimetilációja által egyes tumorszupresszorok génexpressziójának csökkenését eredményezi. Az útvonal upstream szabályozó elemei azonban még nem ismertek. A MP MYPT1 szabályozó alegységével történő pull down vizsgálatot követő proteomikai elemzéssel sikerült kimutatnunk a Mg2+-függő protein foszfatáz 1 B (PPM1B) enzimet, mint lehetséges kölcsönható fehérjét. A fehérje-fehérje kölcsönhatást DuoLink Proximity Ligation esszével is igazoltuk HeLa sejtekben. A PPM1B specifikus gátlószerével, a Sanguinarine-nal (SNG) történő kezelés a MP inaktivációját okozta, amelyet a MYPT1 gátló Thr850 foszforiláció Western blot elemzésével és a sejtlizátumok miozin foszfatáz aktivitásmérésével igazoltunk foszforilált miozin könnyű lánc szubsztráttal. Az SNG kezelés a PRMT5 Thr80 aktivációs foszforilációjához vezetett, amely növekvő szimmetrikus H4 hiszton dimetilációt eredményezett. A sejtvonalon nyert adatainkat humán betegmintákon is igazoltuk Western blot analízissel. Az egészségeses és cervix carcinoma biopsziák össehasonlítása, a PPM1B közel teljes eliminációját mutatta a daganatos szövetekben. A MYPT1pT850 gátló, a PRMT5pT80 aktivációs oldalláncainak szintje szignifikánsan nőtt, továbbá a H4 hiszton szimmetrikus dimetilációjának mértéke is. Ezek alapján a PPM1B/MP enzimek tumorszuppresszor szereppel bírnak azáltal, hogy gátolják a PRMT5 enzimet. A PPM1B ígéretes tumormarkernek bizonyulhat cervikális daganatokban.

Témavezető: Dr. Lontay Beáta és Dr. Keller Ilka

A fehérjék reverzibilis foszforilációja-defoszforilációja számos sejtfolyamat fontos szabályozási mechanizmusa. Ezért a sejtek foszforilációs állapotát kialakító protein kináz/foszfatáz enzimpárok szabályozása évtizedek óta a kutatások középpontjában áll. Munkacsoportunk számos olyan molekulát azonosított, amelyek a defoszforilációs reakciók 90 %-ért felelős protein foszfatáz-1 (PP1) és a protein foszfatáz-2A (PP2A) enzimeket gátolni vagy aktiválni képesek, ezért akár gyógyszerjelöltek is lehetnek. Ugyanakkor, kevés információnk van arról, hogy a már forgalomban lévő gyógyszerek hogyan hatnak a PP1 és PP2A aktivitására. Ezért célul tűztük ki az Amerikai (USA) Gyógyszerhatóság (FDA) által engedélyezett 774 gyógyszerből készített könyvtár (Screen-Well® FDA Approved Drug Library V2 version 1.2) vizsgálatát PP1 és PP2A effektorok azonosítására. A szűrés során a foszkárnet (Na-foszfonoformiát), a bifoszfonátot tartalmazó alendronát, valamint a hasonló szerkezetű (a könyvtárban nem található) rizendronát és klodronát gátolta a PP1 (IC50=13,8-100 µM) és a PP2A (0,03-12,4 µM) katalitikus alegységek (PP1c és PP2Ac) aktivitását is. Az echinokandin családba tartozó mikafungin a PP1c aktivitását gátolta (IC50= 80,6 µM), míg a PP2Ac-t aktiválta (EC50= 22,9 µM). HeLa sejtek kivonatának foszfatáz aktivitása kismértékben csökkent alendronát vagy foszkárnet jelenlétében 1 órás kezelés hatására, ezzel szemben a mikafungin kezelés foszfatáz aktiválást eredményezett. A mikafungin a HeLa (LD50= 37,89 µM) és a HepG2 (LD50= 73,55 µM) sejtek 24 órás kezelését követően csökkentette a sejtek életképességét, míg az alendronát csak a HeLa (LD50= 94,1 µM) sejtek esetében váltott ki számottevő életképesség csökkenést, a foszkárnet pedig hatástalan volt. A HeLa sejtek foszkárnet vagy alendronát kezelését követően a miozin foszfatáz regulátor alegység gátló foszforilációs helyének (P-Thr696-MYPT1) és a 20 kDa miozin könnyűlánc (P-Ser19-MLC20) foszforilációjának növekedését detektáltuk western blot technikával. Eredményeink arra utalnak, hogy néhány engedélyezett gyógyszer a protein foszfatázok aktivitását befolyásolja in vitro és a sejtekben is, ezzel számos sejtfolyamat szabályozásában részt vehetnek. Ezek a mechanizmusok feltehetően hozzájárulhatnak e gyógyszerek mellékhatásainak kialakulásához.

Témavezető: Dr. Kónya Zoltán és Dr. Erdődi Ferenc

Előzetes vizsgálataink során megállapítottuk, hogy a szöveti transzglutamináz (TG2) expresszálódik a faggyúmirigyekben, és azt találtuk, hogy központi szerepe lehet a faggyúsejtek lipidraktározásának szabályozásában. TG2 hiányában a faggyúsejtek nagyobb mennyiségben halmozták fel a lipidcseppeket, amely jelenség az autofágia alacsonyabb szintjével járt együtt. Mivel az autofágia energiaigényes folyamat, célunk volt megvizsgálni, hogy a megfigyelt eredmények összefüggésben lehetnek-e a mitokondriumok megváltozott működésével. Kísérleteinkhez vad típusú (WT) és TG2 hiányos (KO) SZ95 faggyúsejt sejtvonalakat használtunk, mely utóbbit munkacsoportunk CRISPR/Cas9 módszerrel hozott létre. Méréseinkhez lézer pásztázó citometriát, Western blot, microarray és mikroszkópos high-content screening módszereket használtunk. Lézer pásztázó citometria eredményeink alapján a TG2 KO sejtek mitokondriális membránpotenciálja szignifikánsan alacsonyabb volt a WT sejtekéhez képest. Kimutattuk továbbá, hogy a mitokondriális légzési lánc fehérjéi, a mitokondriális I. (NDUFB8), a III. (UQCRC2) és az V. (ATP5A1) komplexek alacsonyabb szinten fejeződnek ki a KO faggyúsejtekben. Microarray kísérleteink alapján a TG2 KO szebocitákban számos mitokondriumhoz kapcsolódó gén expresszálódik eltérően a WT sejtekhez képest. A mitokondriumok Mito Tracker festését követően a high-content screening eredményeink alapján a mitokondriális morfológia azonban nem volt eltérő a TG2 KO faggyúsejtekben a WT sejtekhez képest.  Összességében eredményeink arra utalnak, hogy TG2 hiányában a faggyúsejtek mitokondriális funkciói több ponton is károsodtak, ami további vizsgálatokat tesz szükségessé annak feltárására, hogy ez milyen szerepet játszhat a bőrgyógyászati betegségek patogenezisében vagy a terápiás stratégiák kidolgozásában.

Témavezető: Dr. Fedor-Lénárt Kinga

A vázrendszer, különösképpen a nagyízületek rendellenességei jelentős terhet rónak az egészségügyi ellátórendszerekre. Az ízületi porc helyreállítását célzó terápiás próbálkozások továbbra is kihívást jelentenek, ami elsősorban a porcszövet sajátos biológiai tulajdonságainak köszönhető. Jelen kutatás kiindulópontja, hogy a porcszövet kialakulása során a mesenchymalis őssejtek, illetve az érett chondrocyták metabolikus szempontól eltérőek. A porcszövet ereket nem tartalmazó szövet, ahol hipoxiás viszonyok uralkodnak. A chondrocyták jól alkalmazkodtak a hipoxiához, és anyagcseréjükre elsősorban az anaerob útvonalak dominanciája jellemző. A chondrogenesis során a metabolikus útvonalak jelentős átalakuláson esnek át, ennek pontos mikéntjéről azonban jelenleg hiányosak az ismereteink. Ezért arra kerestük a választ, hogy a porcszövet fejlődése során hogyan változnak az anyagcsere-útvonalak a differenciálódó sejtekben. A porcdifferenciáció modellezéséhez csirkeembriók végtagtelepjeiből izolált mesenchymalis sejtekből előállított micromass sejtkultúrákat használtunk. A spontán porcosodó kultúrákat 6 napig tartottuk fent, és a porcdifferenciáció alatt az anyagcsere-útvonalakat különböző inhibitorokkal (pl. a glikolízist 2-D-glükózzal, az ATP-szintézist oligomicinnel) gátoltuk. A porcdifferenciáció mértékét csökkentett glükóztartalmú médiumban történő tenyésztést követően is vizsgáltuk. A mitokondriális aktivitást MTT-assay segítségével, a képződött porcmatrix mennyiségét metakromáziás (dimetil-metilénkék) festéssel detektáltuk. A porcspecifikus gének expresszióját RT-qPCR segítségével vizsgáltuk. Eredményeink alapján a 6 napig tartó differenciációs folyamat során alkalmazott csökkentett glükóztartalmú, illetve metabolikus inhibitorokat tartalmazó médium különböző módon gátolta a porcdifferenciáció folyamatát, azonban a tenyésztés vége felé alkalmazott csökkentett glükóztartalmú környezet fokozta a porcképződés mértékét, amelyet metakromáziás festéssel és a génexpresszió szintjén is sikerült kimutatnunk. A csökkentett glükóztartalmú környezet elősegítheti az érett porcsejt-fenotípus kialakulását, és hozzájárulhat a porcregenerációs eljárások hatékonyságának növeléséhez.

Témavezető: Dr. Matta Csaba

Az akut mieloid leukémia (AML) a vérképzőrendszerből kiinduló rosszindulatú betegség, melyben a fehérvérsejtek éretlen, normális védekező működésre még nem képes formái felszaporodnak, és a csontvelőben a normális véralkotó sejteket termelő sejtek működését visszaszorítják. A leukémia egy másik típusa, az akut limfoblasztos leukémia (ALL), amely a vérképző őssejtek rosszindulatú burjánzása. A kóros sejtek képtelenek differenciálódni, fiziológiás érésük elmarad, tömeges képződésük kiszorítja a normális csontvelői elemeket. A leukémia gyors, és agresszív lefolyású formája. Az izocitrát-dehidrogenáz (IDH) a citromsavciklus egyik kulcs enzimje, amelynek mutált formái nagy mennyiségben termelik a 2-hidroxi-glutarátot, ami vélhetően epigenetikai módosulást idéz elő a mieloid prekurzorsejtekben és így kóros sejtdifferenciálódást eredményez.  A kutatásom témája, a leukémiás gyermekek és fiatal felnőttek vér és csontvelő mintáinak a tanulmányozása. Fő cél a daganatos állapotra jellemző metabolitok mennyiségének mérésére alkalmas eszköztár optimalizálása volt. A célcsoport a gyermek és fiatal felnőtt AML-ben és ALL-ben szenvedő betegek.  A kutatás során olyan analitikai módszerek optimalizálására törekedtünk, amelyek alkalmasak a csontvelő és vérminták metabolomikai vizsgálatára. Aquity H-class UPLC (Waters) és 5500 QTRAP (Sciex) LC-MS rendszeren végeztük a vizsgálatainkat. A kromatográfiás adatokat Empower (Waters), míg a tömegspektrometriás adatokat a Skyline szoftverek segítségével értékeltük ki. Munkánk során optimalizáltunk egy folyadékkromatográfiás elválasztást és tömegspektrometriás detektálást tartalmazó módszert szerves savak, aminosavak és a 2–hidroxi-glutarát onkometabolit analízisére. A pilot kísérletünk során 3 betegből származó csontvelő-vér mintapár metabolitjait vizsgáltuk meg.

Témavezető: Prof. Csősz Éva és Guba Andrea