OETDK.

Articular cartilage is a special type of connective tissue that does not contain any blood vessels. Because of this, the microenvironment around the tissue is hypoxic. Hypoxia-inducible factors (HIFs) are key regulators of the intracellular responses upon low tissue oxygen levels. Since hypoxia plays a significant role in the differentiation of chondroprogenitor cells, a possible therapeutic strategy for cartilage diseases such as osteoarthritis can be centered on mimicking the effects of hypoxia-inducible factor-1 alpha (HIF-1a). HIFs are also involved in the modulation of circadian clock that serves as the central regulator of diverse physiological functions over a period of approximately 24 hours, and synchronises secondary oscillators within peripheral tissues like articular cartilage. Our aim was to investigate the impact of specific HIF modulating treatments on the synchronization of the circadian clock during in vitro cartilage formation. Chondroprogenitor cells were isolated from developing limb buds of 4.5-day-old chicken embryos to establish chondrifying high-density (HD) cultures. Samples were treated with dimethyloxalylglycine (DMOG) administered at different concentrations across distinct time periods. Samples were also placed into hypoxic incubator (1% O₂, 10% CO₂). Metachromatic dimethyl methylene blue (DMMB) staining was utilised for detecting cartilage-specific extracellular matrix alterations. Cell viability was investigated through MTT assay. Real-time quantitative polymerase chain reaction was used to detect alterations in chondrogenic-(SOX9, COL2A1, ACAN), circadian clock- (BMAL1, PER2, CRY2), pluripotency-(NANOG, POU5F3, SOX2) and hypoxia-specific (HIF1a) mRNA expression patterns. In vitro chondrogenesis was stimulated when DMOG was applied at a concentration of 100 µM on culturing day 0 for 24 hours. However, application of more concentrated solutions or longer treatment periods led to the inhibition of cartilage formation. Circadian clockwork was positively affected when hypoxic treatment was applied during the earliest stage of in vitro chondrogenesis. This work was supported by the Young Researcher Excellence Programme (grant number: FK-134304) of the National Research, Development and Innovation Office, Hungary.

Témavezető: Dr. Vágó Judit

The dorsal horn of the spinal cord has a specialized circuit that processes and relays pain-related information. This circuit is made up of neurons that are among the last to be born during neurogenesis, and they differentiate into an inhibitory and excitatory neuronal population. They form a functional circuit that transmits pain-related information to higher brain regions such as the brainstem reticular formation and the thalamus. Our study aimed to learn more about the birth interval of these brainstem neurons. That is, our goal was to identify those neurons in the brainstem that are born at the same time as the spinal nociceptive neurons. To this end, we labeled the neurons in the brainstem and the spinal cord with GFP on the 12.5th day of gestation (E12.5) by in utero electroporation. After a one-month postnatal period (p28), mice were sacrificed, and fixed with transcardial perfusion with paraformaldehyde. For histological analyses, coronal free-floating serial brain sections were subjected to immunohistochemistry, specifically targeting labeled neuroprogenitor cells using anti-GFP antibodies. The Allen Brain Atlas was utilized for identification of mature cells derived from labeled neuroprogenitors. Microscopic examination of brain sections demonstrated the integration of late-born neurons into major sensory pathways, including the Dorsal Column-Medial Lemniscal (DCML) pathway, spinothalamic tract, spinal trigeminal pathway, pain modulatory pathways, as well as auditory and visual pathways. These results augment our understanding of the formation of distinct sensory networks among neurons born at the same developmental time point. 

Témavezető: Dr. Mészár Zoltán Mihály

The development of the vertebrate hindbrain is controlled by hox genes, which work together to create a precise schedule for the differentiation of neurons. This is essential for the assembly of functional circuits. We hypothesized that neurons born in different regions of the central nervous system at the same time preferentially connect to form functional circuits (same-born-same-circuit theory). Previously, we found that the latest neurons born in the spinal dorsal horn were those that populate the posterior thoracic nucleus (nucleus of Clarke) in lamina VII. These neurons project axons through the spinocerebellar tract, which forms the mossy fibers and terminates in the granular layer of the cerebellar cortex. We aimed to learn more about the developmental schedule of the neurons that provide inputs to the cerebellum by mapping those neurons born at the same time as the posterior thoracic nucleus. To label neurons born at the same time, we injected a GFP coding DNA expression vector into the fourth ventricle of 12.5-day-old mouse embryos. We transfected the newborn neurons with in utero electroporation technique and allowed the embryos to grow and be born. We then let the mice reach young adult age (P28), and after that, we sacrificed and fixed them by transcranial perfusion with formaldehyde. We dissected their brains with the spinal cord and selected them based on successful GFP labeling. We made serial sections of the hindbrain regions, and the GFP signal was enhanced with immunohistochemistry. The histochemical reaction was visualized with diaminobenzidine, and the sections were mounted on histological slides. In the spinal cord, we found dense labeling in the Clarke nucleus, as well as in the superficial spinal dorsal horn. The labeling in the deep lamina was more prominent among the astrocytes, indicating that neurogenesis is followed by gliogenesis in a temporally overlapping manner. We also found labeling in the reticular nuclei and vestibular nuclei of the brainstem. However, we did not find labeled cerebellar granule cells, but we did find dense labeling of the cerebellar glomeruli. We only found scattered labeling among the Purkinje cells, and we also labeled Golgi cells in some cases. Our results support our same-born-same-circuit theory but remain controversial due to the lack of granule cell labeling.

Témavezető: Dr. Zoltán Mihály Mészár

Az agykéreg különböző feladatokat ellátó területeinek, például a tanulásért és az emlékezetért felelős hippokampusznak a működése nagymértékben függ a bazális előagyi magokból kiinduló serkentő és gátló idegpályák szabályozásától. A bazális előagyi magok közé tartozik a mediális szeptum (MS) és a Broca-féle diagonális köteg horizontális ága (HDB). Felszálló rostjaik az agykéreg különböző kognitív funkciókkal rendelkező területeit innerválják, amelyek a figyelem, a motiváció és a memóriafolyamatok szempontjából alapvető fontosságúak. Bár elfogadott, hogy a hippokampusz kolinerg innervációja kizárólag az MS-ből származik, megfigyeltünk egy eddig ismeretlen kolinerg innervációt is a HDB-ből a hippokampuszba. Ezen kolinerg sejtek vizsgálata elengedhetetlen ahhoz, hogy megismerjük a memóriafolyamatok működését egészséges és kóros állapotban, ezért további anatómiai és viselkedéstani módszerekkel vizsgáltuk funkciójukat. Munkánk során ezeket a sejteket anterográd, retrográd és monoszinaptikus rabies pályajelölés, elektronmikroszkópia, kemogenetika, szálfotometria, valamint immunhisztokémia kombinálásával vizsgáltuk egerekben. Azt találtuk, hogy a HDB kolinerg sejtjei, egyrészt más rétegeit innerválják a hippokampusznak, mint a MS sejtjei, másrészt kollaterálisaikon keresztül egyidejűleg innerválják a különböző funkciókat ellátó ventrális és dorzális hippokampuszt, harmadrészt más régiókból kapnak bemenetet, mint MS hippokampuszt beidegző sejtjei. Továbbá felfedeztük, hogy a HDB kolinerg sejtjei célzottan idegzik be az újdonság kódolását végző mohasejteket. Végül pedig szálfotometriai és kemogenetikai technikák segítségével vizsgáltuk a HDB kolinerg sejtjeinek működését és szerepét különböző viselkedési tesztek során. Korábbi vizsgálataink folytatásául számos új, részben anatómiai megfigyelést tettünk. Eredményeink új megvilágításba helyezik a hippokampusz tanulási és memóriafolyamatainak kolinerg szabályozását, és új irányt adhatnak az olyan betegségek jobb megértéséhez, mint az Alzheimer-kór, amely összefügg a kolinerg degenerációval.

Témavezető: Dr. Nyiri Gábor és Dr. Baloghné Dr. Bereczky Zsuzsanna

A terhesség során alkalmazott ultrahang diagnosztika a legfontosabb szűrőmódszer a fejlődési rendellenességek kiszűrésére. Az ultrahang, mint fizikai hatás befolyásolja a fejlődő neuronok morfológiáját. Korábbi adataink alapján akár már egy diagnosztikában használt UH vizsgálat is befolyásolja a neuronok dendritfa szerkezetét, illetve a rajtuk elhelyezkedő dendrittüskék tulajdonságait. A dendritfa az általunk korábban vizsgált frontális és hippocampális régióban szignifikánsan dúsabb elágazódást mutatott, mely a megemelkedett dendrittüske sűrűséggel együtt valószínűleg a neuronok receptív mezőjét befolyásolhatja. Korábbi irodalmi adatok alapján a nem diagnosztikus UH expozíció mind pozitív, mind negatív irányba módosítani tudja a kísérleti állatok kognitív funkcióját.  Célkitűzés: A repetitív diagnosztikus ultrahang modellállatok kognitív funkciójára való hatásának vizsgálata.  Anyagok és módszertan: A vizsgálataink kivitelezéséhez CD1 egértörzs nőstényeket használtunk. A kezelt állatokat a klinikai gyakorlatban is 5 alkalommal használt UH expozíciónak vetettük alá, FR 3,5 mHz, MI>1, TI>1, időtatam 8 perc. A vizsgált állatok UH expozíciót E18,5., PN7., 14., 21., 28. napokon kaptak. A kontroll állatokat azonos protokollnak vetettük alá, de azokon UH expozíciót nem alkalmaztunk. Az utolsó UH expozíció után 2 nappal Morris water maze tesztet használtunk az állatok memória funkciójának vizsgálatára.  Eredményeink alapján az UH expozíciónak kitett csoport a vizsgálat első napján jobb eredményt ért el a kontroll csoporthoz képest, viszont a későbbiekben (2.,3. nap) a két csoport eredménye már korrelált egymással. Egyedüli szignifikáns eredményt abban találtunk, hogy az UH kezelt állatok a cél quadránsban több időt töltöttek el. Eredményeink alapján a repetitív diagnosztikus UH-nak semmilyen adverz hatása nincs a memóriára.

Témavezető: Dr. Papp Tamás és Dr. Károlyi Péter

A halló- és egyensúlyozószerv egy rendkívül komplex érzékszerv, amelynek nagy része az os temporaléban foglal helyet. 3 fő része a külső fül, középfül és belső fül. A magyar orvosi egyetemek anatómia oktatásán belül ez a terület nem kerül boncolásra, mivel a nehéz preparálási technika sok időt venne igénybe. A terület bemutatása főként atlasz ábrák és 3 dimenziós anatómiai modellek segítségével történik. Munkám során célul tűztem ki, hogy egy sokak számára, akár gyakorlatokon használható, otthonról is elérhető virtuális modellt állítsak elő egy preparátum segítségével, amely képes az in situ helyzetet a lehető legnagyobb részletességgel és pontossággal bemutatni. A boncolás lépéseit digitális fényképezőgéppel való dokumentálással és a 4D Interactive Anatomy® szkenner és program használatával örökítettem meg. A preparálás során a minden boncteremben megtalálható eszközparkon kívül használtam még egy fogászati fúrót cserélhető fejekkel és kompatibilis vágóeszközzel. A 4D Interactive Anatomy® szkennerével a boncolás minden rétegéről egy külön képsorozatot készítettem, ahol vízszintes síkban 360°-ban körbe fordulva 3°-onként, függőleges síkban 0-81°-ig 3°-onként készült egy kép. A közép- és belső fül feltárását az os temporale pyramisának felső oldala felől, a basis cranii interna középső scalajában kezdtem meg a dura mater eltávolítását követően. Véső és kalapács, valamint a fogorvosi fúró segítségével távolítottam el a csigát és a félkörös ívjáratokat körülvevő csontszövetet, valamint a dobüreg paries tegmentalisát. Bemutattam a hallócsontokat, a dobüreget, dobhártyát, külső hallójáratot, valamint a külső fül porcos lemezét és az azt körülvevő zsírszövetet. A készített felvételeken jól látszik az V. agyideg dúca is. A szkenner által készített képeket egy arra alkalmas szoftverben öszzeillesztettem 3 síkban forgatható modellé, a különböző rétegek képeit pedig egymásra illesztettem. A boncolás menetét térben és időben is végig követő munka jött létre egy 4D modell a preparálási folyamatról, amivel többlet információ nyerhető az anatómiai térség struktúráiról, azok környezetéről és egymáshoz viszonyított helyzetéről.

Témavezető: Dr. Juhász Tamás

Régóta ismert, hogy a gerincvelői szenzoros ingerületfeldolgozást végző neuronális hálózatok működését az agytörzs különböző területeiről kiinduló leszálló pályák befolyásolni képesek. A leszálló moduláló pályák elsődleges célpontjai olyan lokális, a gerincvelő hátsó szarvában található interneuronok, amelyek pre- és posztszinaptikus mechanizmusokkal szólnak bele a normális szenzoros ingerületátadásba. Ezen interneuronok közé tartoznak az endogén opioid tartalmú sejtek közé tartozó enkefalinerg neuronok. Munkacsoportunk korábban igazolta, hogy az enkefalinerg neuronok szelektív ingerlése a primer afferens eredetű feed-forward gátlást fokozza, valamint, hogy a gátló és serkentő enkefalinerg interneuronok egymással is monoszinaptikus kapcsolatokat tudnak kialakítani. Munkám során arra kerestem a választ, hogy a nociceptív ingerületfeldolgozásban kulcsfontosságú felszínes hátsó szarvi neuronokon milyen pre- és posztszinaptikus hatások detektálhatók az enkefalinerg neuronok szelektív optogenetikai aktiválása eredményeképpen. Méréseimet 1-3 hónapos PENK::ChR2 hibrid egereken végeztem, mely állatokban az enekefalin tartalmú neuronok egy fényérzékeny nem szelektív kationcsatornát, channelrhodopsin-2-t expresszálnak. A felületes hátsó szarv területén teljes-sejt patch-clamp technikával elvezetett neuronok primer afferens bemenetét elektromos ingerléssel aktiváltam, míg az enkefalinerg sejteket 470nm hullámhosszúságú fényimpulzusokkal stimuláltam szelektíven. Eredményeim alapján elmondható, hogy a véletlenszerűen elvezetett hátsó szarvi sejtek többsége rendelkezett a sejttestre, vagy dendritekre érkező direkt posztszinaptikus enkefalinerg bemenettel, melyek dominálóan serkentők voltak (és különböző formájú plaszticitásra utaló jeleket mutattak). A sejtek által fogadott primer afferens bemenetek amplitúdóját az enkefalinerg sejtek szelektív ingerlése különböző mértékben változtatta. Érdekes módon a korábban megfigyelt feed-forward gáltlást egy esetben sem figyeltük meg, ami ennek a jelenségnek a sejtspecifikus voltára utal. Eredményeink alapján elmondható, hogy a felszínes hátsó szarv ökoszisztémájában az enkefalinerg sejtek kifejezetten fontos szereppel bírnak.

Témavezető: Dr. Szücs Péter

A PACAP a hypothalamo-hypophysealis rendszerben felfedezett neuropeptid, mely számos perifériás szövetben is kimutatható. Pozitív hatással van a porcképződésre, és megváltoztatja az ízületporc egyes alkotóelemeinek expresszióját. A PAC1 receptor aktiválásán keresztül a porcképződés szempontjából fontos Sox9 transzkripciós faktort aktiválja, melyen keresztül a megfelelő teherbírású ízületek kialakításáért felelős. Kutatásaink során fiatal és öreg PAC1 receptor génhiányos, heterozigóta és vad típusú egerek hátsó végtagjait vizsgáltuk. A térdízületek, intartarsalis (IT), tarsometatarsalis (TM) és metatarsophalangealis (MP) ízületek esetleges eltéréseit azonosítottuk. Újszülött Black-6-os vad típusú (VT), PAC1 heterozigóta (HZ) és PAC1 knock out (KO) egerek végtagjait, valamint 1 évnél idősebb VT és PAC1 HZ végtagjait az állatok terminálása után eltávolítottuk. A ízületeit preparáltuk, majd 4%-os EDTA-ban dekalcináltuk és 7 µm-es sorozatmetszeteket készítettünk. vDMMK és picrosirius vörös festéseket készítettünk, majd Nikon mikroszkóp segítségével dokumentáltuk. A P-Sox9 transzkripciós faktor lokalizációját immunhisztokémiával vizsgáltuk. A PAC1 KO egerek csak néhány napig életképesek, azonban térdízületeiben a PAC1 receptor hiánya növelte a porcvastagságot, hasonló módon az IT ízületekhez. A TM és MP ízületek vastagsága nem változott. Az idős HZ egyedek térdízületének vastagsága lényegesen csökkent a VT alomtársaihoz képest, míg a lábakat alkotó ízületek porcvastagsága nem változott lényegesen. A II-es típusú kollagén vastagsága mind a KO és HZ állatokban csökken fiatal és idős egyedekben egyaránt. A P-Sox9 nukleáris transzlokációja a kor előrehaladtával csökkent a VT állatokban, míg a HZ állatokban alig változott. Az eredmények alapján a PAC1 receptor megfelelő időben történő aktiválása fontos befolyásoló tényező az ízületi porc szerkezetének megtartásában. Hiánya idős korban súlyos patológiai kórképek kialakulásához vezethet. Támogató: NKFIHK139396

Témavezető: Dr. Juhász Tamás és Fillér Csaba

A hypothalamusból izolált neuropeptid a hypophysis adenilát-cikláz aktiváló polipeptid (PACAP) számos szövet differenciációjában, pl.  a porcszövet fejlődésében tölt be fontos szerepet. In vivo két izoformáját azonosították eddig, a PACAP 1-38-at és a PACAP 1-27-et, melyek G-fehérje kapcsolt PAC1 receptoron keresztül fejti ki hatásukat. A PACAP KO egerekben korai osteoarthritisra (OA) jellemző elváltozások jelentkeztek PACAP hiányában. OA-ben szenvedő betegek synovialis folyadékából izolált chondroprogenitor (CPC) sejtekre gyakorolt hatása azonban még ismeretlen. Kutatásunk célja a PACAP kezelés hatásainak vizsgálata ezen CPC sejtek differenciációjára. A CPC sejteket PACAP 1-38-al kezeltük. A sejtek életképességét MTT assay-vel, míg a proliferációt tríciált timidin beépüléssel mértük. Hematoxilin-eosin festési eljárást követően a sejtek rövidebb és hosszabb átmérőjét lemértük, továbbá megvizsgáltuk a sejtek differenciációját, dimetil-metilénkék festéssel. A kollagéntermelést tríciált prolin beépülésével detektáltuk, valamint picrosirius festéssel vizsgáltuk annak orientációját. Western blottal nyomon követtük a Sox9 transzkripciós faktor expresszióját és intracelluláris lokalizációját immuncitokémiával vizsgáltuk. A PACAP-al történő kezelés nem vezetett apoptotikus folyamatok beindulásához, a CPC sejtek proliferációs képessége szignifikánsan nem változott. A PACAP 1-38 adagolás a sejtek lekerekedését eredményezte, illetve jellemző volt a tenyészetek esetében a nodulusok képződése, mely a megnövekedett metakromatikusan festődő extracelluláris mátrix termelésével volt magyarázható. A CPC sejtek kollagéntermelése nem változott szignifikáns mértékben, de PACAP kezelések hatására polarizált fényt kettősen törő kollagéntípus jelent meg. A Sox9 foszforilált formája expressziója emelkedett és jelentős magi transzlokációt mutatott. Az eddigi kutatásaink során kapott eredményeink a PACAP in vivo gyógyászati alkalmazására teremthetnek lehetőséget OA-ben szenvedő betegek esetében. Támogató: NKFIHK139396

Témavezető: Dr. Juhász Tamás és Fillér Csaba